用以产生被遗传修饰来表达所选抗体的B细胞的系统和方法技术方案

描述了用以对B细胞进行遗传修饰以表达所选抗体的系统和方法。所述系统和方法能够用于：免除对经典疫苗接种的需要；提供针对当前无疫苗接种可用的感染物的保护；当患者另外经受免疫抑制时提供针对感染物的保护；和/或提供由治疗性抗体诸如在治疗自体免疫病症方面提供的益处。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用以产生被遗传修饰来表达所选抗体的B细胞的系统和方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年10月20日提交的美国临时专利申请号62/575,275、2017年11月1日提交的美国临时专利申请号62/580,303以及2018年1月29日提交的美国临时专利申请号62/623,371的优先权，所述美国临时专利申请中的每一者以引用的方式整体并入本文，所述引用的程度就好像在本文中完全阐述一样。关于序列表的声明与本申请相关的序列表以文本格式替代纸质拷贝加以提供，并且据此以引用的方式并入说明书中。含有序列表的文本文件的名称是18-024-WO-PCT_ST25.txt。文本文件是184KB，于2018年10月19日创建，并且正通过EFS网进行电子提交。专利
本公开提供了用以对B细胞进行遗传修饰以表达所选抗体的系统和方法。所述系统和方法能够用于：免除对经典疫苗接种的需要；提供针对当前无疫苗接种可用的感染物的保护；当患者另外经受免疫抑制时提供针对感染物的保护；和/或提供由治疗性抗体诸如在治疗自体免疫病症方面提供的益处。专利技术背景疫苗被设计来通过刺激B细胞以产生针对所靶向感染物的抗体来使受试者针对特定感染的免疫性增加。常规儿科疫苗接种是一种建立已久的临床干预，伴有相比较来说较低风险和较高功效。然而，不幸的是，疫苗接种不可用于所有感染物。作为一个实例，在美国，每年有数百万儿童由于感染呼吸道合胞病毒(RSV)而就医或造访急诊室。数十年来，研究者已试图开发可诱导B细胞以产生有效针对病毒诸如RSV、人免疫缺陷病毒(HIV)和寨卡病毒(Zikavirus)进行保护的抗体的疫苗。但用以诱导保护性抗体的所有尝试都已失败。得到广泛测试的唯一RSV疫苗实际上使得感染更加恶化：在疫苗接种之后产生的抗体不使病毒丧失能力，而是反而使它感染细胞的能力增强。除RSV、HIV和寨卡病毒之外，还有许多无有效疫苗可用的其他感染物。除抗击感染之外，抗体还可适用作针对其他疾患诸如自体免疫疾病的治疗剂。然而，这些基于抗体的疗法通常要求重复注射抗体以维持保护作用。还值得注意的是，众多患者经受骨髓或造血干细胞移植作为针对血液恶性肿瘤(例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)的治疗。其他患者接受提供患者缺乏的治疗性基因的经遗传修饰造血干细胞的输注。所有这些治疗都要求在施用移植物或经遗传修饰造血干细胞之前移除患者的现有免疫系统，从而在治疗之后在患者的免疫系统达成群体恢复之前留下危险的免疫抑制窗。在这个免疫抑制时间期间，患者极其易感于感染诸如RSV、流感、副流感和偏肺病毒(MPV)。这些感染是高风险因素，并且与在这些治疗之后的众多死亡相关联。
技术实现思路
本公开提供了用以对B细胞进行遗传修饰以表达所选抗体的系统和方法。在特定实施方案中，所选抗体降低或免除对现有疫苗接种的需要。在特定实施方案中，所选抗体针对由当前无有效疫苗接种策略可用的病毒(例如RSV、HIV、寨卡)所致的感染进行保护。在特定实施方案中，所选抗体降低或免除对治疗性抗体注射诸如被施用来治疗各种自体免疫病症的那些的需要。在特定实施方案中，所选抗体保护免疫抑制患者免遭感染。在特定实施方案中，本公开方法可用于对B细胞进行重新编程以针对数百种不同感染物或病原体进行保护，所有重新编程都通过涵盖数天的单一实验室操作达成。在特定实施方案中，本公开通过将遗传构建体靶向插入B细胞的内源性基因组的特定区域中来提供这些益处。重要的是，由于B细胞内的遗传序列具有为抗体多样性所需的高可变性，所以对这些细胞的遗传修饰是困难的。这个高度遗传变异性使得直接靶向抗体编码区以进行遗传操作不切实际。此外，移除和替换B细胞的基因组的编码部分也不有效，因为这个方法会负性影响B细胞功能。关于对B细胞进行遗传修饰以表达所选抗体的额外挑战因为抗体由被称为重链和轻链的不连续蛋白质单元形成而产生。不同链由B细胞基因组的不同部分编码，然而必须集合以形成功能性抗体。本公开通过鉴定B细胞基因组的可被可靠地靶向以进行遗传插入，以及在被修饰时导致所插入遗传构建体相比于B细胞的天然基因组的相应部分被优先表达的恒定区来克服所指示挑战以及其他挑战。这个策略克服与B细胞基因组相关的序列可变性，并且还克服对移除和替换内源性B细胞基因组的部分以实现所选抗体的功能性表达的需要。克服对移除和替换内源性B细胞基因组的部分的需要会保持在遗传操作之后的B细胞功能。在特定实施方案中，被靶向以进行遗传插入的所指示区域是在SEQIDNO:85(人)或SEQIDNO:86(小鼠)的Eμ增强子元件的上游或下游的内含子区域。在特定实施方案中，被靶向以进行遗传插入的区域是选自SEQIDNO:1或2(人)或SEQIDNO:3或4(小鼠)的恒定内含子区。在特定实施方案中，SEQIDNO:1内的用以靶向以进行遗传插入的人DNA序列包括SEQIDNO:5-24。在特定实施方案中，SEQIDNO:2内的用以靶向以进行遗传插入的人DNA序列包括SEQIDNO:25-44。在特定实施方案中，SEQIDNO:3内的用以靶向以进行遗传插入的小鼠DNA序列包括SEQIDNO:45-64。在特定实施方案中，SEQIDNO:4内的用以靶向以进行遗传插入的小鼠DNA序列包括SEQIDNO:65-84。特别能够靶向这些位点以进行遗传修饰的遗传序列在本公开内描述为引导RNA(gRNA)SEQIDNO:87-89以及290-366。在特定实施方案中，所插入遗传构建体的放置和组分导致所述所插入遗传构建体相比于B细胞的内源性基因组的相应部分被优先表达。这些实施方案还包括克服与抗体的部分由内源性B细胞基因组的不同区域编码相关的挑战的元件。在特定实施方案中，遗传构建体被插入SEQIDNO:1、2、3和4中的一者中，并且包括(i)启动子；(ii)信号肽；(iii)编码所选抗体的整个轻链的转基因；(iv)柔性接头或跳跃元件；(v)所选抗体的重链的可变部分；和(vi)导致B细胞的内源性重链恒定区的表达的剪接接合点。在这些实施方案中，以单一构建体形式表达所选抗体会克服与抗体的部分由内源性B细胞基因组的不同区域编码相关的挑战。对柔性接头的包括使所表达所选抗体的轻链部分和重链部分以允许它们形成功能性单元，并且同时使抗体部分与来自B细胞的内源性基因组的其他潜在表达的抗体链结合的风险降低的方式进行物理连接。对跳跃元件的使用不使轻链部分和重链部分进行物理连接，但它们以紧密邻近方式进行的表达也导致缔合以形成功能性单元，同时使抗体部分与来自B细胞的内源性基因组的其他潜在表达的抗体链结合的风险降低。对剪接接合点的包括导致所选抗体包括适合于B细胞的当前活化和/或成熟状态的重链恒定区。换句话说，可表达具有B细胞的内源性重链恒定区中的任一者的所选所表达抗体，并且与所选抗体一起表达的重链恒定区可天然地随时间而变化。本公开还提供了用以确保仅有已被有效遗传修饰来表达所选抗体的B细胞被收集以进行配制和向患者施用的方法。举例来说，在遗传修饰之前，B细胞将天然地表达包括κ轻链或λ轻链的抗体。B细胞可被修饰来表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对B细胞进行遗传修饰以表达帕利珠单抗的方法，所述方法包括向SEQ ID NO:1中插入包含重链启动子以及编码帕利珠单抗的整个轻链、Gly-Ser接头和帕利珠单抗的重链的可变区的核酸序列的遗传构建体，由此对所述B细胞进行遗传工程改造以表达帕利珠单抗。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171020 US 62/575,275;20171101 US 62/580,303;20181.一种对B细胞进行遗传修饰以表达帕利珠单抗的方法，所述方法包括向SEQIDNO:1中插入包含重链启动子以及编码帕利珠单抗的整个轻链、Gly-Ser接头和帕利珠单抗的重链的可变区的核酸序列的遗传构建体，由此对所述B细胞进行遗传工程改造以表达帕利珠单抗。


2.一种对B细胞进行遗传工程改造以表达所选抗体的方法，所述方法包括向SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4中插入包含或编码(i)重链启动子、(ii)信号肽、(iii)所述所选抗体的全长轻链；(iv)柔性接头或跳跃元件；(v)所述所选抗体的重链的可变区；和(vi)剪接接合点的遗传构建体，由此对所述B细胞进行遗传工程改造以表达所述所选抗体。


3.如权利要求2所述的方法，其中所述B细胞的内源性可变重链编码基因组在遗传修饰期间不切除。


4.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体、抗人免疫缺陷病毒(HIV)抗体、抗登革病毒抗体、抗百日咳博德特氏菌抗体、抗丙型肝炎抗体、抗流感病毒抗体、抗副流感病毒抗体、抗偏肺病毒(MPV)抗体、抗巨细胞病毒抗体、抗艾伯斯坦巴尔病毒抗体；抗单纯疱疹病毒抗体、抗艰难梭菌细菌毒素抗体或抗肿瘤坏死因子(TNF)抗体。


5.如权利要求2所述的方法，其中所述遗传构建体包含SEQIDNO:102-175、278、279或280-289。


6.如权利要求2所述的方法，其中所述柔性接头在所述所选抗体的所述全长轻链与所述所选抗体的所述重链的所述可变区之间。


7.如权利要求2所述的方法，其中所述柔性接头选自SEQIDNO:180-184。


8.如权利要求2所述的方法，其中所述柔性接头是包含50-80个氨基酸的Gly-Ser接头。


9.如权利要求2所述的方法，其中所述柔性接头是包含57个氨基酸的Gly-Ser接头。


10.如权利要求2所述的方法，其中所述柔性接头是SEQIDNO:122。


11.如权利要求2所述的方法，其中所述跳跃元件在所述所选抗体的所述全长轻链与所述所选抗体的所述重链的所述可变区之间。


12.如权利要求2所述的方法，其中所述跳跃元件是自裂解肽。


13.如权利要求12所述的方法，其中所述自裂解肽选自SEQIDNO:176-179。


14.如权利要求2所述的方法，其中所述跳跃元件是内部核糖体进入位点(IRES)。


15.如权利要求2所述的方法，其中所述重链启动子选自SEQIDNO:111和128。


16.如权利要求2所述的方法，其中所述重链启动子是IgVH1-69或J558H10。


17.如权利要求2所述的方法，其中所述信号肽选自SEQIDNO:118、134以及185-194。


18.如权利要求2所述的方法，其中所述信号肽源于人IgH重链或人IgL轻链。


19.如权利要求2所述的方法，其中所述遗传构建体包含同源臂。


20.如权利要求19所述的方法，其中所述同源臂包含SEQIDNO:90-101、110、125、127、140、142、143、153、170、171、173、174、278或279。


21.如权利要求2所述的方法，其中所述遗传构建体编码标签。


22.如权利要求21所述的方法，其中所述标签包括标签II、His标签、Flag标签、Xpress标签、Avi标签、钙调蛋白标签、多谷氨酸标签、HA标签、Myc标签、Nus标签、S标签、SBP标签、Softag1、Softag3或V5标签。


23.如权利要求21所述的方法，其中所述标签包含SEQIDNO:122或195-204。


24.如权利要求2所述的方法，所述方法还包括将选自SEQIDNO:87-89以及290-366中的一者或多者的引导RNA(gRNA)序列和核酸酶递送至所述B细胞。


25.如权利要求24所述的方法，其中所述递送通过电穿孔、纳米粒子或病毒介导的递送来达成。


26.如权利要求2所述的方法，其中所述遗传构建体是腺相关病毒载体的一部分。


27.如权利要求24所述的方法，其中所述gRNA和所述核酸酶通过电穿孔递送，并且所述遗传构建体作为腺相关病毒载体的一部分加以递送。


28.如权利要求24所述的方法，其中所述核酸酶是Cas9或Cpf1。


29.如权利要求24所述的方法，其中由所述gRNA序列中的一者或多者靶向的靶标序列选自SEQIDNO:5-84中的一者或多者，并且所述gRNA选自SEQIDNO:87-89以及290-366中的一者或多者。


30.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是抗RSV抗体，包括帕利珠单抗、AB1128或ab20745。


31.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是：含有包含SEQIDNO:138的重链和包含SEQIDNO:136的轻链的帕利珠单抗；含有包含SEQIDNO:138的重链和包含SEQIDNO:205的轻链的帕利珠单抗；含有包含SEQIDNO:123的重链和包含SEQIDNO:120的轻链的抗RSV抗体；或含有包含SEQIDNO:123的重链和包含SEQIDNO:206的轻链的抗RSV抗体。


32.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是含有包含SEQIDNO:207的CDRH1、包含SEQIDNO:208的CDRH2、包含SEQIDNO:209的CDRH3；包含SEQIDNO:210的CDRL1、包含SEQIDNO:211的CDRL2和包含SEQIDNO:212的CDRL3的抗RSV抗体。


33.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是抗HIV抗体，包括10E8、VRC01、ab18633或39/5.4A。


34.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是含有包含SEQIDNO:150的重链和包含SEQIDNO:149的轻链的抗HIV抗体。


35.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是含有包含SEQIDNO:213的CDRH1、包含SEQIDNO:214的CDRH2、包含SEQIDNO:215的CDRH3、包含SEQIDNO:216的CDRL1、包含SEQIDNO:217的CDRL2和包含SEQIDNO:218的CDRL3，或包含SEQIDNO:219的CDRH1、包含SEQIDNO:220的CDRH2、包含SEQIDNO:221的CDRH3、包含QYGS的CDRL1、包含SGS的CDRL2和包含SEQIDNO:222的CDRL3的抗HIV抗体。


36.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是抗登革病毒抗体，包括抗体55、DB2-3、ab155042或ab80914。


37.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是含有包含SEQIDNO:223的CDRH1、包含SEQIDNO:224的CDRH2、包含SEQIDNO:225的CDRH3；包含SEQIDNO:226的CDRL1、包含SEQIDNO:227的CDRL2和包含SEQIDNO:228的CDRKL3，或包含SEQIDNO:229的CDRH1、包含SEQIDNO:230的CDRH2、包含SEQIDNO:231的CDRH3、包含SEQIDNO:232的CDRL1、包含SEQIDNO:233的CDRL2和包含SEQIDNO:234的CDRL3的抗登革病毒抗体。


38.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是含有包含SEQIDNO:235的重链和包含SEQIDNO:236的轻链的抗百日咳抗体。


39.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是抗丙型肝炎抗体，包括MAB8694或C7-50。


40.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是含有包含SEQIDNO:237的CDRH1、包含SEQIDNO:238的CDRH2、包含SEQIDNO:239的CDRH3、包含SEQIDNO:240的CDRL1、包含SEQIDNO:241的CDRL2和包含SEQIDNO:242的CDRL3的抗丙型肝炎抗体。


41.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是抗流感病毒抗体，包括C102。


42.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是含有包含SEQIDNO:159的重链和包含SEQIDNO:158的轻链的抗流感病毒抗体。


43.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是含有包含SEQIDNO:243的CDRH1、包含SEQIDNO:244的CDRH2、包含SEQIDNO:245的CDRH3、包含SEQIDNO:246的CDRL1、包含KTS的CDRL2和包含SEQIDNO:247的CDRL3的抗流感病毒抗体。


44.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是抗MPV抗体，包括MPE8。


45.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是抗CMV抗体，包括MCMV5322A、MCMV3068A、LJP538或LJP539。


46.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是含有包含SEQIDNO:168的重链和包含SEQIDNO:166的轻链的抗EBV抗体。


47.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是含有包含SEQIDNO:248的CDRH1、包含SEQIDNO:249的CDRH2、包含SEQIDNO:250的CDRH3、包含SEQIDNO:251的CDRL1、包含SEQIDNO:252的CDRL2和包含SEQIDNO:253的CDRL3的抗EBV抗体。


48.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是抗HSV抗体，包括HSV8-N和MB66。


49.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是抗艰难梭菌抗体，包括阿克托单抗或贝兹托单抗。


50.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是抗TNF抗体，包括英夫利昔单抗、阿达木单抗、依那西普、塞利珠单抗或它们的被接受的生物类似物。


51.如权利要求2所述的方法，其中所述所选抗体是含有包含SEQIDNO:254的重链和包含SEQIDNO:255的轻链；包含SEQIDNO:256的CDRH1、包含SEQIDNO:257的CDRH2和包含SEQIDNO:258的CDRH3；包含SEQIDNO:259的CDRL1、包含SEQIDNO:260的CDRL2和包含SEQIDNO:261的CDRL3；包含SEQIDNO:262的CDRH1、包含SEQIDNO:263的CDRH2和包含SEQIDNO:264的CDRH3；包含SEQIDNO:265的CDRL1、包含SEQIDNO:266的CDRL2和包含SEQIDNO:267的CDRL3；包含SEQIDNO:268的CDRH1、包含SEQIDNO:269的CDRH2和包含SEQIDNO:270的CDRH3；或包含SEQIDNO:271的CDRL1、包含SEQIDNO:272的CDRL2和包含SEQIDNO:273的CDRL3的抗TNF抗体。


52.如权利要求2所述的方法，其中遗传修饰利用包括SEQIDNO:87、88、89、90-175、278-366中的任一者的序列。


53.如权利要求2所述的方法，其中所述B细胞是抗体产生性B细胞、记忆B细胞、原初B细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·J·泰勒，H·F·莫菲特，
申请(专利权)人：弗莱德哈钦森癌症研究中心，
类型：发明
国别省市：美国;US