使用遗传标记的甲基化状态区分转移性-致死性前列腺癌与惰性前列腺癌制造技术

描述区分受试者的转移性‑致死性前列腺癌PCa与惰性PCa的方法和试剂盒。所述方法和试剂盒利用遗传标记的甲基化状态。区分转移性‑致死性PCa与惰性PCa在比先前可用者更早的时间点告知更具针对性的疗法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用遗传标记的甲基化状态区分转移性-致死性前列腺癌与惰性前列腺癌相关申请的交叉引用本申请要求2015年12月23日提交的美国临时专利申请第62/387,273号的优先权，所述申请以全文引用的方式并入本文中。关于联邦资助研究或发展的声明本专利技术是在政府支持下在由美国国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的CA097186下进行。政府对本专利技术享有一定权利。序列表的参考创建于或大约创建于2016年12月20日的文件大小为612KB的名为“DN1LK5845.txt(SequenceListing.txt)”的计算机可读文本文件含有此申请的序列表并以全文引用的方式并入本文中。
本公开内容提供使用在肿瘤组织中评价的遗传标记的甲基化状态区分转移性-致死性前列腺癌(PCa)与惰性PCa的方法和试剂盒。遗传标记包括基因间1、基因间2、基因间3、PI15、FHAD1、ALKBH5、KLHL8和/或ATP11A内的CpG甲基化位点。
技术介绍
前列腺癌(PCa)为生物学上和临床上异质性疾病，2015年美国预期有220,800名新的病例和27,540例癌症特异性死亡，并且在世界范围内每年有超过300,000例死亡。PCa最常具有惰性过程，但20-30％患者的子组发展为癌转移并最终死于PCa。迄今，预后的最重要单一预测因子为格里森分数，病理学家通过组织学检查活检组织分配格里森分数。然而，格里森分数经常不准确，尤其在少量肿瘤可用的时候。通过比较诊断性活检与后续前列腺切除术的格里森分数，分别发生14％到51％和9％升级和降级。此外，尽管具有格里森分数3+3＝6的肿瘤风险较低并且具有格里森分数4+4＝8或更高的肿瘤风险较高，但3+4或4+3的肿瘤为异质的并且包括大量肿瘤。因此，研究工作聚焦于发现预后生物标记，所述预后生物标记可以改善用于靶向那些患者最可能受益的疗法的患者分类。最近的生物标记研究主要聚焦于变化的肿瘤组织基因表达谱，从而引起针对肿瘤侵袭性的mRNA标签的测试的研发。肿瘤DNA的表观遗传变化也可以提供有价值的预后信息。研究最广泛的表观遗传修饰为DNA甲基化，其发生在整个基因组的CpG位点并调节基因表达。迄今，DNA甲基化和PCa进展的研究限制于与生物化学(即前列腺特异性抗原，PSA)复发有关的候选基因的小组。尽管具有生物化学进展的患者有较高风险发生PCa相关死亡，但此仍为生物学上异质群组并且大多数将不会死于PCa。在根除性前列腺切除术之后具有生物化学复发的患者的研究发现在10年的中值随访之后仅17％到21.5％死于PCa。
技术实现思路
研究原发前列腺癌症的表观基因组广泛的DNA甲基化图谱。研究包括具有针对转移性进展和癌症特异性死亡的长期随访的基于群体的根除性前列腺切除术组。本研究的目标为检测区分转移性-致死性PCa与惰性PCa或非复发性疾病的差异甲基化CpG生物标记。区分具有转移性-致死性可能性的肿瘤与在诊断之后五年或更多年内不会复发的更加惰性的肿瘤的八种差异甲基化CpG经鉴别并随后在独立患者组中验证。这些表观遗传生物标记改善针对患有临床局部疾病的新诊断的前列腺癌患者进行的预后判定和临床决定。这些CpG标记包括基因间1；基因间2；FHAD1；ALKBH5；KLHL8；ATP11A；基因间3；以及PI15。这些CpG标记的甲基化状态的检测组合改善格里森得分的预后辨别。附图说明图1.两个前列腺癌(PCa)患者群体的特征。图2.用于弗雷德·哈钦森癌症研究中心(FredHutchinsonCancerResearchCenter；FH)组中的转移性-致死性PCa分类的排名靠前的42种DNA甲基化生物标记。图3.在自举样品中选择42种DNA甲基化生物标记的次数(n＝100，每个准则)。图4.用于分类在东弗吉尼亚医学院(EasternVirginiaMedicalSchool；EV)组中的转移性-致死性PCa的八种经验证DNA甲基化生物标记。图5.用于预测八种经验证DNA甲基化生物标记和格里森分数的转移性-致死性PCa的ROC曲线。图6.用于区分将每种CpG与EV组中的格里森分数组合的模型中的转移性-致死性PCa的八种经验证DNA甲基化生物标记的预测性能。图7.用于焦磷酸测序的引物。所有引物均在5'-3'取向中列出。图8.焦磷酸测序结果与HM450结果的相关性。图9A、9B.(9A)使用通过焦磷酸测序验证的5种CpG标记构建的选择模型。(9B)相比于单独格里森分数，使用5种CpG标记与格里森分数的拟合模型结果。具体实施方式前列腺癌(PCa)为生物学上和临床上异质性疾病，2015年美国预期有220,800名新的病例和27,540例癌症特异性死亡，并且在世界范围内每年有超过300,000例死亡。PCa可能为惰性的(即，在诊断和治疗的5年内不复发，并且即使保持不治疗也可能不会引起问题)或可能复发。这些类型的PCa区别于转移性-致死性PCa。目前，预后的最重要单一预测因子为格里森分数，病理学家通过组织学检查活检组织分配格里森分数。然而，格里森分数经常不准确，尤其在少量肿瘤可用的时候。通过比较诊断性活检与后续前列腺切除术的格里森分数，分别发生14％到51％和9％升级和降级。此外，尽管具有格里森分数3+3＝6的肿瘤风险较低并且具有格里森分数4+4＝8或更高的肿瘤风险较高，但3+4或4+3的肿瘤为非均相的并且包括大部分肿瘤。因此，研究工作聚焦于发现预后生物标记，所述预后生物标记可以改善用于靶向那些患者最可能受益的疗法的转移性-致死性PCa与惰性PCa的分层。最近的生物标记研究已主要聚焦于变化的基因表达，从而引起针对肿瘤侵袭性的mRNA标签的测试的研发。肿瘤DNA的表观遗传变化也可以提供有价值的预后信息。表观遗传指代并非由突变引起的基因表达的变化(即基因的序列变化，如核苷酸的损失或获得)。因此，表观遗传为由除突变以外的若干机制引起的基因表达的可逆调节。研究最广泛的表观遗传修饰为DNA甲基化。其它表观遗传变化包括以下各者的变化：DNA的三维结构、组蛋白蛋白修饰、微RNA抑制性活性、压印、X不活化和长距离染色体相互作用。DNA甲基化发生在整个基因组的CpG位点并调节基因表达。胞嘧啶为构建DNA的四种构筑嵌段(即胞嘧啶(C)、硫胺(T)、腺嘌呤(A)和鸟苷(G))的群组中的一种(即核苷酸)。胞嘧啶的化学结构呈六面六边形或嘧啶环形式。胞嘧啶可以沿着单一DNA链在线性序列中与鸟苷成对以形成5'-CG-3'或CpG对。“CpG”是指胞嘧啶-磷酸盐-鸟苷化学键，其中磷酸盐将两个核苷酸结合在一起。在哺乳动物中，在70-80％这些CpG对中，胞嘧啶经甲基化。(查特基(Chatterjee)等人,《生物化学与生物物理学报(BiochemicaetBiophisicaActa)》2012；1819:763-70)。术语“CpG岛”指代具有高浓度CG二核苷酸对或CpG位点的基因组中的区域。由CpG岛占据的DNA的长度通常为300-3000个碱基对。CpG岛可以由各种准则界定，所述准则包括占据DNA的至少200个碱基对(bp)的复发性CG二核苷酸对的长度，至少50％的链段的CG含量，和/或所观测到的/所预期的CpG比大于60％。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种区分受试者的转移性‑致死性前列腺癌PCa与惰性PCa的方法，包含：从所述受试者获得原发肿瘤组织样品；分析所述样品以检测位于一或多种选自以下各项的表观遗传基因座的胞嘧啶的甲基化状态：基因间1、基因间2、FHAD1、ALKBH5、KLHL8、ATP11A、基因间3和PI15；基于所述分析获得每个所选表观遗传基因座的值；计算β差值；以及基于所述β差值判定所述样品是转移性‑致死性PCa或惰性PCa，进而区分所述受试者的转移性‑致死性前列腺癌PCa与惰性PCa。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.23 US 62/387,2731.一种区分受试者的转移性-致死性前列腺癌PCa与惰性PCa的方法，包含：从所述受试者获得原发肿瘤组织样品；分析所述样品以检测位于一或多种选自以下各项的表观遗传基因座的胞嘧啶的甲基化状态：基因间1、基因间2、FHAD1、ALKBH5、KLHL8、ATP11A、基因间3和PI15；基于所述分析获得每个所选表观遗传基因座的值；计算β差值；以及基于所述β差值判定所述样品是转移性-致死性PCa或惰性PCa，进而区分所述受试者的转移性-致死性前列腺癌PCa与惰性PCa。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述胞嘧啶是CpG对的一部分。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述CpG对位于CpG岛内。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述胞嘧啶位于CpG位点：cg01135464；CpG位点：cg02223001；CpG位点：cg02394978；CpG位点：cg07166550；CpG位点：cg16713292；CpG位点：cg21513610；CpG位点：cg22501793；和/或CpG位点：cg24349665内。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述胞嘧啶是所述所选表观遗传基因座内的CpG对内的所有胞嘧啶。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述计算β差值是利用来源于患有惰性PCa的受试者群体的参考水平。7.根据权利要求6所述的方法，其中基因间1、基因间2、基因间3和/或PI15的正β差值将所述样品区分为转移性-致死性PCa。8.根据权利要求6所述的方法，其中基因间1、基因间2、基因间3和/或PI15的负β差值将所述样品区分为惰性PCa。9.根据权利要求6所述的方法，其中FHAD1、ALKBH5、KLHL8和/或ATP11A的负β差值将所述样品区分为转移性-致死性PCa。10.根据权利要求6所述的方法，其中FHAD1、ALKBH5、KLHL8和/或ATP11A的正β差值将所述样品区分为惰性PCa。11.根据权利要求1所述的方法，其中计算β差值是利用来源于患有转移性-致死性PCa的受试者群体的参考水平。12.根据权利要求11所述的方法，其中基因间1、基因间2、基因间3和/或PI15相比于所述参考水平的负β差值将所述样品区分为惰性PCa。13.根据权利要求11所述的方法，其中基因间1、基因间2、基因间3和/或PI15的正β差值将所述样品区分为转移性-致死性PCa。14.根据权利要求11所述的方法，其中FHAD1、ALKBH5、KLHL8和/或ATP11A的正β差值将所述样品区分为惰性PCa。15.根据权利要求11所述的方法，其中FHAD1、ALKBH5、KLHL8和/或ATP11A的负β差值将所述样品区分为转移性-致死性PCa。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含分析所述样品以检测位于基因间1；基因间2；FHAD1；ALKBH5；KLHL8；ATP11A；基因间3；以及PI15的胞嘧啶的甲基化状态。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含分析所述样品以检测位于基因间1的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间2；FHAD1；ALKBH5；KLHL8；ATP11A；基因间3；以及PI15中一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含分析所述样品以检测位于基因间2的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；FHAD1；ALKBH5；KLHL8；ATP11A；基因间3；以及PI15中一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含分析所述样品以检测位于FHAD1的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；ALKBH5；KLHL8；ATP11A；基因间3；以及PI15中一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。20.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含分析所述样品以检测位于ALKBH5的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；FHAD1；KLHL8；ATP11A；基因间3；以及PI15中一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。21.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含分析所述样品以检测位于KLHL8的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；FHAD1；ALKBH5；ATP11A；基因间3；以及PI15中一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。22.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含分析所述样品以检测位于ATP11A的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；FHAD1；ALKBH5；KLHL8；基因间3；以及PI15中一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。23.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含分析所述样品以检测位于基因间3的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；FHAD1；ALKBH5；KLHL8；ATP11A；以及PI15中一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。24.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含分析所述样品以检测位于PI15的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；FHAD1；ALKBH5；KLHL8；ATP11A；以及基因间3中一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。25.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含分析所述样品以检测位于ALKBH5、FHAD1、KLHL8和PI15中一或多种的胞嘧啶的甲基化状态且其中所述甲基化状态改善格里森评分的预后判定。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述格里森分数为4+3＝7或3+4＝7格里森分数。27.根据权利要求25所述的方法，其中所述格里森分数为<＝6或8到10格里森分数。28.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是原发PCa肿瘤样品。29.根据权利要求25所述的方法，其中所述改善的预后判定减少假阴性。30.根据权利要求25所述的方法，其中所述改善的预后判定减少假阳性。31.根据权利要求1所述的方法，其中将所述PCa区分为转移性-致死性指导积极性或实验性治疗。32.根据权利要求1所述的方法，其中将所述PCa区分为惰性指导中度、最小程度或无治疗。33.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析包含基于亚硫酸氢盐的甲基化分析。34.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析包含焦磷酸测序。35.根据权利要求1到34中任一权利要求所述的方法，其中所述β差值是平均β差值。36.一种用于区分转移性-致死性PCa与惰性PCa的试剂盒，包含用以检测位于选自基因间1、基因间2、FHAD1、ALKBH5、KLHL8、ATP11A、基因间3和PI15的一或多种表观遗传基因座的胞嘧啶的甲基化状态的试剂。37.根据权利要求36所述的试剂盒，包含硫酸氢盐和对亚硫酸氢盐转化的DNA具有特异性的PCR引物。38.根据权利要求36所述的试剂盒，包括DNA断裂酶。39.根据权利要求36所述的试剂盒，包含针对SEQIDNO:1到SEQIDNO:5中任一个内的CpG对的靶特异性探针。40.根据权利要求36所述的试剂盒，包含针对CpG位点：cg01135464；CpG位点：cg02223001；CpG位点：cg02394978；CpG位点：cg07166550；CpG位点：cg16713292；CpG位点：cg21513610；CpG位点：cg22501793；和/或CpG位点：cg24349665内的CpG对的靶特异性探针。41.根据权利要求36所述的试剂盒，包含一或多种包括SEQIDNO:6到SEQIDNO:29中一或多种的核苷酸。42.根据权利要求36所述的试剂盒，包含参考水平。43.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述参考水平来源于患有惰性PCa的受试者群体。44.根据权利要求43所述的试剂盒，其中基因间1、基因间2、基因间3和/或PI15的甲基化状态相比于所述参考水平的上调将所述样品区分为转移性-致死性PCa。45.根据权利要求43所述的试剂盒，其中基因间1、基因间2、基因间3和/或PI15的甲基化状态相比于所述参考水平的统计显著差异的缺乏将所述样品区分为惰性PCa。46.根据权利要求43所述的试剂盒，其中FHAD1、ALKBH5、KLHL8和/或ATP11A的甲基化状态相比于所述参考水平的下调将所述样品区分为转移性-致死性PCa。47.根据权利要求43所述的试剂盒，其中FHAD1、ALKBH5、KLHL8和/或ATP11A的甲基化状态相比于所述参考水平的统计显著差异的缺乏将所述样品区分为惰性PCa。48.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述参考水平来源于患有转移性-致死性PCa的受试者群体。49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中基因间1、基因间2、基因间3和/或PI15的甲基化状态相比于所述参考水平的下调将所述样品区分为惰性PCa。50.根据权利要求48所述的试剂盒，其中基因间1、基因间2、基因间3和/或PI15的甲基化状态相比于所述参考水平的统计显著差异的缺乏将所述样品区分为转移性-致死性PCa。51.根据权利要求48所述的试剂盒，其中FHAD1、ALKBH5、KLHL8和/或ATP11A的甲基化状态相比于所述参考水平的上调将所述样品区分为惰性PCa。52.根据权利要求48所述的试剂盒，其中FHAD1、ALKBH5、KLHL8和/或ATP11A的甲基化状态相比于所述参考水平的统计显著差异的缺乏将所述样品区分为转移性-致死性PCa。53.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含用以检测位于基因间1；基因间2；FHAD1；ALK...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·斯坦福，Z·风，
申请(专利权)人：弗莱德哈钦森癌症研究中心，
类型：发明
国别省市：美国,US