一种S-poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种S‑poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法，包括如下步骤：初筛阶段：将结直肠癌53例以及健康人87例分别混合为一份进行筛选，利用S‑poly(T)PCR技术，对已知血液中表达的485miRNA进行检测，分析筛选出存在显著性异常表达的miRNA；复筛阶段：将此前53例结直肠癌样本按照TNM分期，将结直肠癌I‑II期33例、结直肠癌III‑IV期20例及健康人87例样本分别混合成一份，利用S‑poly(T)PCR技术，对第一步中筛选出差异表达的miRNA进行检测，选出备选miRNA用于单个验证；验证阶段：对48例结直肠癌、20例结直肠非癌性息肉、47例健康人血浆样本进行单个验证，分析各miRNA表达水平与病理分期、肿瘤大小、肿瘤位置等的相关性，评估miRNA对结直肠癌的临床诊断能力，本发明专利技术，检测方法，简单，实用。

【技术实现步骤摘要】
一种S-poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法
本专利技术涉及医疗检测
，具体为一种S-poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法。
技术介绍
结直肠癌在我国的发病率高居肿瘤排行榜第五位，其死亡率也一直居高不下，已成为威胁我国公众健康及生命的主要疾病之一，且目前有统计表明，近年来结直肠癌的发病率仍呈逐步升高的趋势，其早、晚期五年生存率存在巨大差距，转移性结直肠癌的五年生存率不足13％，而早期结直肠癌五年生存率可达90％以上，但由于缺乏有效的早期诊断指标和手段，其早期诊断率仍不足结直肠癌诊断的40％，大多数结直肠癌患者入院时已是晚期，错过了最佳治疗的黄金时期。目前结直肠癌的诊断主要依靠结肠镜检查及活体组织病理检查，但由于其花费高并伴随一定的检查痛苦与风险以及由于检查医师技术问题，如肠道准备不全、退镜速度过快等，存在一定漏诊率，难以达到普查要求。CT、MRI等影像学检查由于对结直肠微小病变难以做到早期诊断，并不足以满足临床要求。目前临床常用的粪便隐血试验及肿瘤标志物如CEA等，由于敏感性和特异性不足，不能有效的对结直肠癌进行筛查与早期诊断。寻找一种可用于结直肠癌早期诊断的花费低、创伤小的新型肿瘤标志物已成为一大热点。越来越多研究证明miRNA与肿瘤的发生发展及预后等存在密切关系，有望成为临床肿瘤的一种新型标志物。所以，如何设计一种S-poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法，成为我们当前要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种S-poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种S-poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法，包括如下步骤：1)初筛阶段：将结直肠癌53例以及健康人87例分别混合为一份进行筛选，利用S-poly(T)PCR技术，对已知血液中表达的485miRNA进行检测，分析筛选出存在显著性异常表达的miRNA；2)复筛阶段：将此前53例结直肠癌样本按照TNM分期，将结直肠癌I-II期33例、结直肠癌III-IV期20例及健康人87例样本分别混合成一份，利用S-poly(T)PCR技术，对第一步中筛选出差异表达的miRNA进行检测，选出备选miRNA用于单个验证；3)验证阶段：对48例结直肠癌、20例结直肠非癌性息肉、47例健康人血浆样本进行单个验证，分析各miRNA表达水平与病理分期、肿瘤大小、肿瘤位置等的相关性，评估miRNA对结直肠癌的临床诊断能力。根据上述技术方案，所述初筛阶段对本院收集的53例结直肠癌、87例健康人分别做血浆混合样本，利用S-poly(T)PCR技术检测485个miRNA，按照以下标准：FC(foldchange)>1或FC<-1、p<0.05，单个样本Ct值<35，筛选出显著差异的16种miRNA，其中2种miRNA上调，14种miRNA下调。根据上述技术方案，所述复筛阶段利用S-poly(T)PCR技术检测16种miRNA，按照三组间均差异表达的标准，最终选定9种miRNA用于单个验证，其中8种miRNA下调表达，1种miRNA上调表达。根据上述技术方案，所述验证阶段对48例结直肠癌、20例非癌性息肉、47例正常对照组血浆样本进行单个验证，结果显示：其中7种miRNA可显著区分结直肠癌与正常人：miR-27a-3p(t＝6.11，p<0.00)、miR-144-3p(t＝7.34，p<0.00)、miR-148a-3p(t＝5.01，p<0.00)、miR-423-3p(t＝6.48，p<0.00)、miR-424-5p(t＝6.68，p<0.00)、miR-425-5p(t＝7.74，p<0.00)、miR-1260b(t＝4.87，p<0.00)，此7种miRNA均为下调表达。根据上述技术方案，所述验证阶段中结直肠癌组样本miR-27a-3p、miR-143-3p、miR-144-3p、miR-148a-3p、miR-423-3p、miR-424-5p、miR-425-5p、miR-483-5p、miR-1260b的FC采用2^-ΔΔCt值法(FC(foldchange)＝2^-ΔΔCt，ΔΔCt＝ΔCt(CRC)–ΔCt(HC)，ΔCt＝AVG(targetmiRNA)–AVG(miR-54))计算。根据上述技术方案，所述验证阶段中对上述筛选出来的7个miRNA进行ROC曲线分析，miR-27a-3p、miR-143-3p、miR-144-3p、miR-148a-3p、miR-424-5p、miR-425-5p、miR-1260b的AUC值分别为：0.881、0.777、0.887、0.871、0.919、0.910、0.848，按照AUC值在0.5～0.7时提示有较低准确性，AUC在0.7～0.9时提示有一定准确性，AUC在0.9以上时提示有较高准确性，各miRNA的AUC值均超过0.7，其灵敏度和特异度分别为75.0％和85.0％、72.9％和78.7％、93.8％和78.7％、79.2％和91.5％、79.2％和93.6％、83.3％和91.5％、81.3％和83.3％，均有一定准确性，且miR-424-5p、miR-425-5p的AUC值超过0.9。根据上述技术方案，所述所有结直肠癌样本均经过金标准石蜡病理切片确诊，与金标准的比较对于miRNA的诊断价值非常重要，结合ROC曲线得到的cutoff值以及术后病理结果，我们可以得到石蜡病理切片和qRT-PCR检测法对同一份标本的检测结果，可建立对7种miRNA的配对格表进行一致性检验。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术本利用S-poly(T)PCR筛选结直肠癌miRNA诊断标记物，经过三步法筛选出miR-27a-3p、miR-143-3p、miR-144-3p、miR-148a-3p、miR-424-5p、miR-425-5p、miR-1260b等7个miRNA对结直肠癌诊断具有临床标记物价值，与病理石蜡诊断有较好的一致性；miR-144-3p、miR-425-5p、miR-1260b三种miRNA联合诊断结直肠癌的灵敏度和特异性均超过90％，远超过目前临床常用的CEA等肿瘤标志物，具有潜在临床应用价值；生物信息学结果显示miR-144-3p显著富集于轴突传导、PI3K、PDGF等传导通路，miR-425-5p主要富集于Ca离子信号通路、鸟苷酸环化酶及cGMP等相关通路，由于现在鲜有报道提示miR-1260b与结直肠癌相关，进行信号通路富集分析是并未发现miR-1260b有任何富集，但仍证明miRNA可通过调控多个靶基因参与信号通路的调节，在结直肠癌的发生、发展中起重要作用，也为血浆中异常表达的miRNA用于结直肠癌诊断提供理论依据。附图说明图1是本专利技术的检测流程图；图2是本专利技术的初筛选出的16种miRNA表；图3是本专利技术的复本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种S‑poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)初筛阶段：将结直肠癌53例以及健康人87例分别混合为一份进行筛选，利用S‑poly(T)PCR技术，对已知血液中表达的485miRNA进行检测，分析筛选出存在显著性异常表达的miRNA；2)复筛阶段：将此前53例结直肠癌样本按照TNM分期，将结直肠癌I‑II期33例、结直肠癌III‑IV期20例及健康人87例样本分别混合成一份，利用S‑poly(T)PCR技术，对第一步中筛选出差异表达的miRNA进行检测，选出备选miRNA用于单个验证；3)验证阶段：对48例结直肠癌、20例结直肠非癌性息肉、47例健康人血浆样本进行单个验证，分析各miRNA表达水平与病理分期、肿瘤大小、肿瘤位置等的相关性，评估miRNA对结直肠癌的临床诊断能力。

【技术特征摘要】
1.一种S-poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)初筛阶段：将结直肠癌53例以及健康人87例分别混合为一份进行筛选，利用S-poly(T)PCR技术，对已知血液中表达的485miRNA进行检测，分析筛选出存在显著性异常表达的miRNA；2)复筛阶段：将此前53例结直肠癌样本按照TNM分期，将结直肠癌I-II期33例、结直肠癌III-IV期20例及健康人87例样本分别混合成一份，利用S-poly(T)PCR技术，对第一步中筛选出差异表达的miRNA进行检测，选出备选miRNA用于单个验证；3)验证阶段：对48例结直肠癌、20例结直肠非癌性息肉、47例健康人血浆样本进行单个验证，分析各miRNA表达水平与病理分期、肿瘤大小、肿瘤位置等的相关性，评估miRNA对结直肠癌的临床诊断能力。2.根据权利要求1的一种S-poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法，其特征在于：所述初筛阶段对本院收集的53例结直肠癌、87例健康人分别做血浆混合样本，利用S-poly(T)PCR技术检测485个miRNA，按照以下标准：FC(foldchange)>1或FC<-1、p<0.05，单个样本Ct值<35，筛选出显著差异的16种miRNA，其中2种miRNA上调，14种miRNA下调。3.根据权利要求1的一种S-poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法，其特征在于：所述复筛阶段利用S-poly(T)PCR技术检测16种miRNA，按照三组间均差异表达的标准，最终选定9种miRNA用于单个验证，其中8种miRNA下调表达，1种miRNA上调表达。4.根据权利要求1的一种S-poly(T)PCR技术检测已知血液中表达的485miRNA的方法，其特征在于：所述验证阶段对48例结直肠癌、20例非癌性息肉、47例正常对照组血浆样本进行单个验证，结果显示：其中7种miRNA可显著区分结直肠癌与正常人：miR-27a-3p(t＝6.11，p<0.00)、miR-144-3p(t＝7.34，p<0.00)、miR-148a-3p(t＝5.01，p<0.00)、miR-423-3p(t＝6.48，p&...

【专利技术属性】
技术研发人员：李富荣，王勇，余涛，戴蘡璎，卫志坚，
申请(专利权)人：深圳市展行生物有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44