乳腺癌分型内远处复发风险基因群及体外诊断产品和应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一组评估乳腺癌分子分型内远处复发风险进行评估的基因群；公开了由检测这些基因群的基因表达水平的试剂在制备用于评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的体外诊断产品中的应用；所述体外诊断产品包括二代测序(NGS)检测试剂盒、定量PCR等；本发明专利技术还公开了利用所述检测试剂盒对乳腺癌分子分型内远处复发风险进行评估的方法。本发明专利技术所述方法对乳腺癌分子分型内远处复发风险的评估具有较高的准确性，同时可以预测这类乳腺癌患者对将来免疫检查点抑制剂的应答。

【技术实现步骤摘要】
乳腺癌分型内远处复发风险基因群及体外诊断产品和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种乳腺癌分型内远处复发风险基因群及体外诊断产品和应用。
技术介绍
乳腺癌在都市人群中的发病率自20世纪80年代末开始一直呈上升趋势，已渐渐成为对都市女性威胁最大的恶性肿瘤。最新调查结果显示：目前上海每年新发乳腺癌的病人已经超过4500人，发病率高居全国榜首。每300名上海女性中，就有1名患乳腺癌。就全国来说，每年大约有30万女性乳腺癌新发病例，并以每年2-3％的比例在上升。美国2013年数据显示，1期乳腺癌的生存率到达100％，2期达到93％，3期达到72％，1990-2007年期间，美国乳腺癌的死亡率以每年2.2％的速度下降，与此同时，中国的乳腺癌死亡率却上升了155％。导致这个差距的重要原因之一是，美国80％的乳腺癌诊断于早期，而中国只有大约20％的乳腺癌患者诊断于早期。对乳腺癌患者的个性化管理，将是提升乳腺癌患者生存率的一大关键点。乳腺癌并非一个简单的单一疾病，而是包括了多种具有不同细胞来源、体细胞突变和病因的肿瘤亚型。因此，乳腺癌病人的病程会有极大差别。常规临床上常用分期、分级结合激素受体状态来显示这些差异)。遗憾的是这些参数对疾病结果的预测能力有限，所以乳腺癌病人常常面临如何选择系统的治疗方案的难题。原发性乳腺癌的基因表达分析揭示了肿瘤内在的异质性，而且作为一种新的分子分型方法弥补了现有标准分级的不足。斯坦福大学前期应用基因表达谱划分的五种乳腺癌亚型是来源于两类功能完全不同的细胞类型，基底细胞和管腔上皮细胞(Perou,C.M.,T.Sorlie,etal.2000；Hu,Z.,C.Fan,etal.2006)。这一分类是基于一种“本征”分析，为一种统计方法，可以发现同一肿瘤内表达差异很小而不同肿瘤间表达差异很大的基因。这些基因可以最好地反映出肿瘤的本征和固有特性。而基因表达的检测则是亚型分型的最佳方法。目前，基于基因表达对乳腺癌进行分型和复发风险评估已得到临床上的广泛认可。北卡罗来纳大学Perou教授与Prosigna合作共同开发出乳腺癌分子分型及复发风险评估产品PAM50，并已得到美国FDA批准。PAM50通过检测55个基因表达水平，将乳腺癌分为4种亚型，管腔A型(LuminalA)、管腔B型(LuminalB)、HER2富集型(HER2-enriched)及基底细胞型(Basal-like)并根据亚型及肿瘤增殖指数评估乳腺癌10年内远处转移的危险性。但是，PAM50乳腺癌基因表达分子分型的方法仍然存在着一些缺陷和不足。首先，没有将乳腺癌预后及治疗效果密切相关的免疫调控基因并将其纳入分析系统，使最终的分型评分系统有一定局限性，尤其是结果不能配合指导目前日益受到重视的肿瘤细胞免疫治疗方案。其次，在同一种亚型内部，例如高危亚型基底细胞(Basal-like)型，尽管其平均远处复发风险较高，在亚型内部仍然存在不同复发风险的亚组，对临床治疗方案的制定有重要意义。在其它乳腺癌亚型内也有同样的发现。第三，测试体系的研发均在美国或欧洲进行，所纳入的病例种族绝大多数为高加索人、少量非洲人和极少数的亚洲人，中国人对测试体系的敏感性和特异性尚未得到有效验证。前期我们在已有乳腺癌分子分型基础上，引入肿瘤组织免疫相关基因表达，进一步完善了乳腺癌分子分型和风险评估体系，并获得国家专利技术专利授权。“一组评估乳腺癌分子分型基因群及其检测试剂盒，专利号CN201410353809.2”。我们的进一步研究还发现，除管腔A型外的其它亚型，在其亚型内部的远处复发风险与部分基因表达水平密切相关，是本专利技术的基础。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对目前高复发风险亚型的乳腺癌进行远处复发风险的进一步评估，提供一组评估乳腺癌分子亚型内远处复发风险基因群及其检测试剂盒，以指导针对不同亚型的中国人群乳腺癌患者的临床治疗。本专利技术提供一组评估乳腺癌分子亚型内远处复发风险基因群及其检测试剂盒，其中评估基底细胞型内远处复发风险基因CD8A、FN1、GREM1、IL2RB、IRF1、POSTN、PRF1、SULF1和UBD；评估HER2富集型乳腺癌远处复发风险基因AEBP1、CD2、CDH11、CKAP2、COL5A1、CXCL9、FBN1、GZMK、HLA-F、HTRA1、PSMB9、STAT1和TAP1；评估管腔B型乳腺癌远处复发风险基因BRF2、C3、CSF1R、EIF4EBP1、HLA-DPB1、HLA-DRA、LSM1、PRR11和RIOK3，所述评估乳腺癌亚型内远处复发风险基因群如表1所示。表1评估乳腺癌分子分型的基因本专利技术提出了一种复发风险基因群作为标志物在制备评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的产品中的应用。本专利技术提出了一种检测所述的复发风险基因群的基因表达水平的试剂在制备用于评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的体外诊断产品中的应用。本专利技术提出了一种评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的体外诊断产品，所述体外诊断试剂包括特异性检测所述复发风险基因群的基因表达水平的试剂。其中，所述体外诊断产品包括二代测序(NGS)检测试剂盒、定量PCR；所述固体支持体包括阵列、微阵列或蛋白质阵列。其中，所述检测试剂盒包括扩增所述复发风险基因群的引物。其中，所述基底细胞型内远处复发风险基因的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQIDNO.1～9所示，所述反向引物的序列如SEQIDNO.10～18所示。其中，所述HER2富集型乳腺癌远处复发风险基因的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQIDNO.19～31所示，所述反向引物的序列如SEQIDNO.32～44所示。其中，所述管腔B型乳腺癌远处复发风险基因的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQIDNO.45～53所示，所述反向引物的序列如SEQIDNO.54～62所示。本专利技术提出了一种所述引物在用于制备评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的产品中的应用。其中，上述乳腺癌分子分型包括基底细胞型、HER2富集型和管腔B型。本专利技术还提出一种检测所述复发风险基因群的方法，其包括以下步骤：(1)利用所述的检测试剂盒提取检测对象的总RNA；(2)将纯化的总RNA反转录为cDNA，然后制成可供二次测序的文库；(3)对步骤(2)所得DNA测序文库进行测序。其中，步骤(2)所述DNA测序文库的构建方法包括以下步骤：将提取的总RNA反转录生成相关基因的cDNA；末端补平并进行5’端磷酸化，将30μ1DNA、45μ1纯水、10μ1具有10mMATP的T4DNA连接酶缓冲液、4μ1包含10mMdNTPMix、5μ1T4DNA聚合酶、1μlKlenow酶、5μ1Τ4连接酶混合后，在20℃温浴30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGENQIAquickPCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA。末端悬液A:将上步的产物溶解在32μ1缓冲液中，加入Klenow缓冲液5μ1，1mMdATP10μ1、KlenowΕχο-3μ1，在37℃保持30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒)，产物由QIAGENMinElutePCR纯化试剂盒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组乳腺癌分子分型内远处复发风险基因群，其特征在于，其包括评估基底细胞型内远处复发风险基因CD8A、FN1、GREM1、IL2RB、IRF1、POSTN、PRF1、SULF1和UBD；评估HER2富集型乳腺癌远处复发风险基因AEBP1、CD2、CDH11、CKAP2、COL5A1、CXCL9、FBN1、GZMK、HLA‑F、HTRA1、PSMB9、STAT1和TAP1；评估管腔B型乳腺癌远处复发风险基因BRF2、C3、CSF1R、EIF4EBP1、HLA‑DPB1、HLA‑DRA、LSM1、PRR11和RIOK3。

【技术特征摘要】
1.一组乳腺癌分子分型内远处复发风险基因群，其特征在于，其包括评估基底细胞型内远处复发风险基因CD8A、FN1、GREM1、IL2RB、IRF1、POSTN、PRF1、SULF1和UBD；评估HER2富集型乳腺癌远处复发风险基因AEBP1、CD2、CDH11、CKAP2、COL5A1、CXCL9、FBN1、GZMK、HLA-F、HTRA1、PSMB9、STAT1和TAP1；评估管腔B型乳腺癌远处复发风险基因BRF2、C3、CSF1R、EIF4EBP1、HLA-DPB1、HLA-DRA、LSM1、PRR11和RIOK3。2.如权利要求1所述的复发风险基因群作为标志物在制备评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的产品中的应用，所述乳腺癌分子分型包括基底细胞型、HER2富集型和管腔B型。3.检测如权利要求1所述的复发风险基因群的基因表达水平的试剂在制备用于评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的体外诊断产品中的应用，所述乳腺癌分子分型包括基底细胞型、HER2富集型和管腔B型。4.一种评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的体外诊断产品，其特征在于，所述体外诊断试剂包括特异性检测如权利要求1所述的复发风险基因群的基因表达水平的试...

【专利技术属性】
技术研发人员：周彤，胡志元，周伟庆，
申请(专利权)人：海门善准生物科技有限公司，上海善准生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32