核酸酶介导的DNA组装制造技术

本文提供了一种方法，所述方法使用序列特异性核酸酶试剂(例如，gRNA‑Cas复合物)组装至少两个核酸以形成具有互补性的末端序列，随后组装所述重叠互补序列。所述核酸酶试剂(例如，gRNA‑Cas复合物)可以在dsDNA中形成双链断裂而形成重叠末端序列，或者可以在每条链上形成切口而产生互补悬垂末端序列。采用本文所述方法进行的组装可以组装任何具有重叠序列的核酸，或者可以使用接合寡核苷酸来组装不具有互补末端的序列。

Nuclease mediated assembly of DNA

This paper provides a method of using the method of sequence specific nucleic acid enzyme reagent (for example, gRNA Cas compound) assembled at least two nucleic acid to form a sequence of complementary, then assembling the overlapping complementary sequence. The nucleic acid enzyme reagent (for example, gRNA Cas compound) double strand breaks can be formed in dsDNA and the formation of overlapping end sequences, or can be formed in each strand incision and overhanging ends complementary sequence. Assembly using the methods described herein may assemble any nucleic acid having overlapping sequences, or may employ binding oligonucleotides to assemble sequences that do not have complementary ends.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸酶介导的DNA组装相关申请的交叉引用本申请要求2014年6月23日提交的美国临时申请No.62/015,809、2014年6月24日提交的美国临时申请No.62/016,400以及2014年8月13日提交的美国临时申请No.62/036,983的权益，这些美国临时申请中的每一篇均据此全文以引用方式并入本文。作为通过EFSWEB提交的文本文件通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表提交，该文件名称为461002SEQLIST.TXT，创建日期为2015年6月23日，文件大小为66KB，并且该文件与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
技术介绍
以往，重叠延伸可用作从重叠合成寡核苷酸合成较大双链DNA分子(特别是基因)的一种手段。然而，这些方法不能有效地以快速的方式组合大DNA分子。此外，使用重叠序列对大核酸进行的位点特异性组合通常受限于重叠序列在待组合的核酸中的所需位置处的可用性。被设计成靶向特异性DNA序列的经工程改造的核酸酶作为遗传操作的强大工具已经引起人们关注，用这些酶可以进行定向的基因缺失、替换和修复以及外源序列插入。然而，现有技术的缺点在于精确度有限，这可导致不可预知的脱靶效应和耗时的多步反应。
技术实现思路
本文提供了用于组装具有重叠序列的核酸的方法。此类方法包括用于组装至少两个核酸的方法，该方法包括：(a)使第一核酸与第一核酸酶试剂接触，其中第一核酸酶试剂在第一靶位点处切割第一核酸，以产生第一经酶切的核酸，在第一经酶切的核酸与第二核酸之间具有重叠末端序列；(b)使第一经酶切的核酸和第二核酸与核酸外切酶接触，以暴露第一经酶切的核酸与第二核酸之间的互补序列；以及(c)组装由步骤(b)生成的两个核酸片段。在一些此类方法中，步骤(c)还包括：(i)使暴露的互补序列退火；(ii)延伸经退火的互补序列的3’端；以及(iii)连接第一核酸和第二核酸。在一些方法中，步骤(a)还包括使第二核酸与第二核酸酶试剂接触，其中第二核酸不包含重叠末端序列，并且第二核酸酶试剂在第二靶位点处切割第二核酸，以产生第二经酶切的核酸，在第一经酶切的核酸与第二经酶切的核酸之间具有重叠末端序列，并且其中步骤(b)的第二核酸是第二经酶切的核酸。在一些方法中，重叠末端序列的长度在20bp至200bp的范围内。在一些方法中，第一核酸酶试剂或第二核酸酶试剂中的至少一者包含靶向第一靶位点或第二靶位点的Cas蛋白和向导RNA(gRNA)(gRNA-Cas复合物)。例如，Cas蛋白可为Cas9蛋白。Cas9蛋白可包含RuvC结构域和HNH结构域，这两个结构域中的至少一者缺少核酸内切酶活性。在一些实施例中，gRNA包含编码成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活CRISPRRNA(tracrRNA)的核酸序列。第一靶位点和/或第二靶位点可被前间区序列邻近基序(PAM)序列侧接。在一些方法中，核酸酶试剂包括锌指核酸酶或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。在一些方法中，第一核酸、第二核酸或这两个核酸来自细菌人工染色体。细菌人工染色体可包含人DNA、啮齿动物DNA、合成DNA或它们的组合。细菌人工染色体可包含人序列。本文所公开的方法包括用于组装至少两个核酸的方法，该方法包括：(a)使第一核酸与第一核酸酶试剂和第二核酸酶试剂接触以产生第一经酶切的核酸，其中第一核酸酶试剂在第一核酸的第一链上的第一靶位点处生成切口，并且第二核酸酶试剂在第一核酸的第二链上的第二靶位点处生成切口，以产生在其末端之一处包含5’或3’悬垂序列的第一经酶切的核酸；(b)使第一经酶切的核酸和包含与5’或3’悬垂序列互补的序列的第二核酸退火；以及(c)连接第一经酶切的核酸和第二核酸。在一些方法中，步骤(b)还包括使用第二链作为模板来延伸第一链的3’端，并且使用第一链作为模板来延伸第二链的3’端。在一些方法中，第一靶位点与第二靶位点相隔至少4bp。在一些方法中，第一核酸酶试剂或第二核酸酶试剂中的至少一者包含靶向第一靶位点或第二靶位点的Cas9蛋白和向导RNA(gRNA)(gRNA-Cas复合物)。gRNA可包含编码成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活CRISPRRNA(tracrRNA)的核酸序列。在一些方法中，第一靶位点和第二靶位点中的至少一者被前间区序列邻近基序(PAM)序列侧接。Cas9蛋白可包含RuvC结构域和HNH结构域，这两个结构域中的一者缺少核酸内切酶活性。在一些方法中，第二核酸不包含与第一经酶切的核酸的5’或3’悬垂序列互补的序列，并且步骤(a)还包括使第一经酶切的核酸和第二经酶切的核酸与接合寡核苷酸接触，其中接合寡核苷酸包含：(i)与第一经酶切的核酸的5’或3’悬垂序列互补的第一互补序列；以及(ii)与第二经酶切的核酸的5’或3’悬垂序列互补的第二互补序列。在一些方法中，第一核酸、第二核酸或这两个核酸来源于细菌人工染色体。细菌人工染色体可包含人DNA、啮齿动物DNA、合成DNA或它们的组合。细菌人工染色体可包含人多核苷酸序列。在一些方法中，第二核酸包含细菌人工染色体。本文所提供的方法还包括用于组装两个或更多个核酸片段的方法，该方法包括：(a)使第一核酸与至少一种核酸酶试剂接触以生成第一经酶切的核酸；(b)使第一经酶切的核酸与第二核酸、接合寡核苷酸和核酸外切酶接触，其中接合寡核苷酸包含：(i)与第一经酶切的核酸互补的第一互补序列；(ii)间区序列；以及(iii)与第二核酸互补的第二互补序列；其中核酸外切酶使第一互补序列和第二互补序列暴露；以及(c)将接合寡核苷酸与第一经酶切的核酸和第二核酸组装在一起。在一些此类方法中，步骤(c)中的组装包括：(i)使接合寡核苷酸的第一互补序列退火到第一经酶切的核酸上，并使接合寡核苷酸的第二互补序列退火到第二核酸上；以及(ii)将接合寡核苷酸连接到第一经酶切的核酸和第二核酸。在一些方法中，接合寡核苷酸的第一互补序列和第二互补序列包含15至120个互补碱基。在一些方法中，接合寡核苷酸的间区序列包含非互补核酸。在一些实施例中，第一经酶切的核酸被无缝地组装到第二核酸。在一些方法中，核酸酶试剂被设计成从将要进行无缝组装的第一核酸末端切割至少20bp片段，其中，接合寡核苷酸的间区序列包含与所述至少20bp片段相同的序列，其中在第一互补序列与所述至少20bp片段之间不存在核酸碱基，并且在第二互补序列与所述至少20bp片段之间不存在核酸碱基，使得所述第一核酸与所述接合寡核苷酸和所述第二核酸的组装重建所述至少20bp片段并无缝地组装第一核酸和第二核酸。在一些方法中，使用来自第二核酸的至少20bp片段作为间区序列来执行相同方法。在一些方法中，间区序列包含约20bp至约120bp。在一些方法中，第二核酸与第二核酸酶试剂和核酸外切酶接触，其中第二核酸酶试剂切割第二核酸，以产生包含与接合寡核苷酸的第二互补序列互补的核苷酸序列的第二经酶切的核酸，其中第一经酶切的核酸被组装到第二经酶切的核酸。在一些方法中，使第二核酸与限制性内切酶或大范围核酸酶和核酸外切酶接触，其中限制性内切酶或大范围本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于组装至少两个核酸的方法，包括：(a)使第一核酸与第一核酸酶试剂接触，其中所述第一核酸酶试剂在第一靶位点处切割所述第一核酸，以产生第一经酶切的核酸，在所述第一经酶切的核酸与第二核酸之间具有重叠末端序列；(b)使所述第一经酶切的核酸和所述第二核酸与核酸外切酶接触，以暴露所述第一经酶切的核酸与所述第二核酸之间的互补序列；以及(c)组装由步骤(b)生成的所述两个核酸片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.23 US 62/015,809;2014.06.24 US 62/016,400;1.一种用于组装至少两个核酸的方法，包括：(a)使第一核酸与第一核酸酶试剂接触，其中所述第一核酸酶试剂在第一靶位点处切割所述第一核酸，以产生第一经酶切的核酸，在所述第一经酶切的核酸与第二核酸之间具有重叠末端序列；(b)使所述第一经酶切的核酸和所述第二核酸与核酸外切酶接触，以暴露所述第一经酶切的核酸与所述第二核酸之间的互补序列；以及(c)组装由步骤(b)生成的所述两个核酸片段。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)还包括：(i)使所述暴露的互补序列退火；(ii)延伸所述经退火的互补序列的3’端；以及(iii)连接所述第一核酸和所述第二核酸。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(a)还包括使所述第二核酸与第二核酸酶试剂接触，其中所述第二核酸不包含所述重叠末端序列，并且所述第二核酸酶试剂在第二靶位点处切割所述第二核酸，以产生第二经酶切的核酸，在所述第一经酶切的核酸与所述第二经酶切的核酸之间具有所述重叠末端序列，并且，其中步骤(b)的所述第二核酸是所述第二经酶切的核酸。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一核酸酶试剂或所述第二核酸酶试剂中的至少一者包含靶向所述第一靶位点或所述第二靶位点的Cas蛋白和向导RNA(gRNA)(gRNA-Cas复合物)。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述Cas9蛋白包含RuvC结构域和HNH结构域，所述两个结构域中的至少一者缺少核酸内切酶活性。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述重叠末端序列的长度在20bp至200bp的范围内。8.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含编码成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活CRISPRRNA(tracrRNA)的核酸序列。9.根据权利要求4至8中任一项所述的方法，其中所述第一靶位点和所述第二靶位点中的至少一者被前间区序列邻近基序(PAM)序列紧邻地侧接。10.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述核酸酶试剂包括锌指核酸酶或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一核酸、所述第二核酸或这两个核酸来自细菌人工染色体。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述细菌人工染色体包含人DNA、啮齿动物DNA、合成DNA或它们的组合。13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述细菌人工染色体包含人序列。14.一种用于组装至少两个核酸的方法，包括：(a)使第一核酸与第一核酸酶试剂和第二核酸酶试剂接触以产生第一经酶切的核酸，其中所述第一核酸酶试剂在所述第一核酸的第一链上的第一靶位点处生成切口，并且所述第二核酸酶试剂在所述第一核酸的第二链上的第二靶位点处生成切口，以产生在其末端之一处包含5’或3’悬垂序列的第一经酶切的核酸；(b)使所述第一经酶切的核酸和包含与所述5’或3’悬垂序列互补的序列的第二核酸退火；以及(c)连接所述第一经酶切的核酸和所述第二核酸。15.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(b)还包括使用所述第二链作为模板来延伸所述第一链的3’端，并且使用所述第一链作为模板来延伸所述第二链的3’端。16.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述第一核酸酶试剂或所述第二核酸酶试剂中的至少一者包含靶向所述第一靶位点或所述第二靶位点的Cas9蛋白和向导RNA(gRNA)(gRNA-Cas复合物)。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述Cas9蛋白包含RuvC结构域和HNH结构域，所述两个结构域中的一者缺少核酸内切酶活性。18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述第一靶位点与所述第二靶位点相隔至少4bp。19.根据权利要求14至18中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含编码成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活CRISPRRNA(tracrRNA)的核酸序列。20.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述第一靶位点和所述第二靶位点中的至少一者被前间区序列邻近基序(PAM)序列紧邻地侧接。21.一种用于组装两个或更多个核酸的方法，包括：(a)使第一核酸与至少一种核酸酶试剂接触以生成第一经酶切的核酸；(b)使所述第一经酶切的核酸与第二核酸、接合寡核苷酸和核酸外切酶接触，其中所述接合寡核苷酸包含：(i)与所述第一经酶切的核酸互补的第一互补序列；(ii)间区序列；以及(iii)与所述第二核酸互补的第二互补序列；其中所述核酸外切酶使所述第一互补序列和所述第二互补序列暴露；以及(c)将所述接合寡核苷酸与所述第一经酶切的核酸和所述第二核酸组装在一起。22.根据权利要求21所述的方法，其中步骤(c)中的组装包括：(i)使所述接合寡核苷酸的所述第一互补序列退火到所述第一经酶切的核酸上，并使所述接合寡核苷酸的所述第二互补序列退火到所述第二核酸上；以及(ii)将所述接合寡核苷酸连接到所述第一经酶切的核酸和所述第二核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯·舒恩赫，约翰·麦克沃特，科里·莫蒙，林恩·麦克唐纳，安德鲁·J·墨菲，格雷格·S·沃肖，约瑟·F·罗哈斯，卡曼·维纳斯·莱，大卫·M·巴伦苏埃拉，凯特琳·蒙塔尼亚，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US