本发明专利技术涉及工程化永生化T细胞系；其制备方法；及其作为药物、特别是用于免疫疗法的用途。本发明专利技术的工程化永生化T细胞系的特征在于例如通过使用内切核酸酶来抑制内源性T细胞受体(TCR)和β2‑微球蛋白(B2M)的表达，所述内切核酸酶能够选择性地使TCR和B2M基因失活，以便使得永生化T细胞是非同种异体反应性的。此外，免疫抑制多肽的表达可在那些工程化永生化T细胞上执行，以便延长这些T细胞在宿主生物体中的存活。此类工程化永生化T细胞特别适用于同种异体移植，尤其是因为它既降低了被宿主的免疫系统排斥的风险，也降低了发生移植物抗宿主病的风险。本发明专利技术为使用永生化T细胞来治疗癌症、感染和自身免疫疾病的标准且负担得起的过继性免疫疗法策略开辟了道路。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经基因修饰以消除T细胞受体和β2-微球蛋白表达的永生化CAR-T细胞序列表本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2018年11月20日，命名为JBI5146WOPCT1_SL.txt，并且大小为67,258字节。
本专利技术涉及表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化永生化T细胞系；其制备方法；及其作为药物、特别是用于免疫疗法的用途。本专利技术的工程化永生化CART细胞的特征在于例如通过使用内切核酸酶来抑制内源性T细胞受体(TCR)和β2-微球蛋白(B2M)的表达，所述内切核酸酶能够选择性地使TCR和B2M基因失活，以便使得永生化CART细胞是非同种异体反应性的。工程化永生化CART细胞系特别适用于同种异体移植，尤其是因为它既降低了被宿主的免疫系统排斥的风险，也降低了发生移植物抗宿主病的风险。本专利技术为使用T细胞来治疗癌症、感染和自身免疫疾病的标准且负担得起的过继性免疫疗法策略开辟了道路。
技术介绍
过继性免疫疗法涉及离体产生的自体抗原特异性T细胞的转移，是治疗病毒感染和癌症的一种有前途的策略。可通过对抗原特异性T细胞的扩增或通过基因工程将T细胞重定向来产生用于过继性免疫疗法的T细胞(Park,Rosenberg等人2011)。通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的遗传转移已成功产生了在T细胞中的新型特异性(Jena,Dotti等人2010)。CAR是由与单个融合分子中的一个或多个信号结构域相关的靶向部分组成的合成受体。一般来讲，CAR的结合部分由例如单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，所述抗原结合结构域包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻链片段和可变片段。第一代CAR的信号结构域源于CD3ζ或Fc受体γ链的胞质区。已证明第一代CAR成功地重定向T细胞的细胞毒性。然而，它们未能在体内提供长效的扩增和抗肿瘤活性。已将来自共同刺激分子(包括CD28、OX-40(CD134)和4-1BB(CD137))的信号结构域单独地(第二代)或组合地(第三代)添加以增强存活并增加CAR修饰的T细胞的增殖。CAR已成功地允许T细胞针对在来自各种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞的表面处表达的抗原进行重定向(Jena,Dotti等人2010)。当前使用过继性免疫疗法治疗患者的方案基于自体细胞转移。在这种方法中，从患者中回收T淋巴细胞，将其进行基因修饰或离体选择、体外培养以便在必要时扩增细胞数量，并且最后输注到患者体内。除了淋巴细胞输注外，可通过支持T细胞移植或其参与免疫应答的其他方式来操纵宿主，所述其他方式例如是预处理(使用放射或化学疗法)和施用淋巴细胞生长因子(诸如IL-2)。每名患者接受使用患者自己的淋巴细胞单独构成的治疗(即自体疗法)。自体疗法在实际应用中面临巨大的技术和后勤障碍，其产生需要昂贵的专用设施和专家人员，它们必须在患者的诊断后短时间内产生，并且在许多情况下，患者的预治疗已导致免疫功能降低，使得患者的淋巴细胞可能功能不佳并且以很低的数量存在。因为这些障碍，每名患者的自体细胞制剂实际上是一种新产品，导致功效和安全性发生巨大变化。理想的是，人们希望使用一种标准化疗法，其中可将同种异体治疗细胞预先制造出、进行详细表征并且可用于立即向患者施用。所谓同种异体是指细胞获自属于相同物种但在遗传上相异的个体。然而，目前使用同种异体细胞具有许多缺点。在具有免疫能力的宿主中，同种异体细胞被迅速排斥，这一过程被称为宿主抗移植物排斥(hostversusgraftrejection，HvG)，并且这大幅限制了转移细胞的功效。在免疫失能的宿主中，同种异体细胞能够移植，但是它们的内源性T细胞受体(TCR)特异性可能将宿主组织识别为异物，从而导致移植物抗宿主病(GvHD)，这可能导致严重的组织损伤和死亡。因此，本领域仍然需要开发规避时间、制造费用以及对患者特异性T细胞产品排斥的风险的方法和试剂。
技术实现思路
本专利技术提供了适用于免疫疗法目的的工程化永生化T细胞系。本专利技术更具体地提供了不表达对免疫识别和组织相容性重要的某些效应分子的T细胞系。在一个总的方面，本专利技术涉及表达CAR的工程化永生化T细胞系，所述CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域包含抗原结合区。本专利技术的工程化永生化T细胞系不表达至少一种内源性T细胞受体(TCR)，并且不表达β2-微球蛋白(B2M)。在一个实施方案中，通过基因敲除来消除所述至少一种内源性TCR和B2M的表达。在一个具体的实施方案中，本专利技术的工程化永生化T细胞系不表达TCR-α。在另一个实施方案中，本专利技术的工程化永生化T细胞系不表达KIR3DL2。在另一个实施方案中，本专利技术的工程化永生化T细胞系不表达B2M。在另一个实施方案中，本专利技术的工程化永生化T细胞系包含CAR，所述CAR包含与肿瘤相关抗原特异性地结合的胞外结构域。在一个具体的实施方案中，工程化永生化T细胞系可包含CAR，所述CAR包含与BCMA特异性地结合的胞外结构域。在另一个实施方案中，工程化永生化T细胞系可包含CAR，所述CAR包含与III型纤连蛋白(FN3)结构域特异性地结合的胞外结构域。在另一个总的方面，本专利技术涉及表达CAR的工程化TALL-104细胞系，所述CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域包含抗原结合区。本专利技术的工程化TALL-104细胞系不表达至少一种内源性T细胞受体(TCR)，并且不表达β2-微球蛋白(B2M)。在一个实施方案中，通过基因敲除来消除所述至少一种内源性TCR和B2M的表达。在一个具体的实施方案中，本专利技术的工程化TALL-104细胞系不表达TCR-α。在另一个实施方案中，本专利技术的工程化TALL-104细胞系不表达KIR3DL2。在另一个实施方案中，本专利技术的工程化TALL-104系不表达B2M。在另一个实施方案中，本专利技术的工程化TALL-104细胞系包含CAR，所述CAR包含与肿瘤相关抗原特异性地结合的胞外结构域。在一个具体的实施方案中，工程化TALL-104系可包含CAR，所述CAR包含与BCMA特异性地结合的胞外结构域。在另一个实施方案中，工程化TALL-104细胞系可包含CAR，所述CAR包含与III型纤连蛋白(FN3)结构域特异性地结合的胞外结构域。在另一个总的方面，本专利技术涉及表达CAR的工程化TALL-104细胞系，所述CAR包含：(a)信号肽，所述信号肽具有SEQIDNO:3的氨基酸序列；(b)胞外结构域，所述胞外结构域包含具有SEQIDNO:8-44中的任一者的氨基酸序列的FN3结构域；(c)铰链区，所述铰链区具有SEQIDNO:4的氨基酸序列；(d)跨膜结构域，所述跨膜结构域具有SEQIDNO:5的氨基酸序列；以及(e)胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的共同刺激结构域以及具有SEQIDNO:7的氨基酸序列的初级信号结构本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化永生化T细胞系，所述CAR包含：/n(a)包含抗原结合区的胞外结构域；/n(b)跨膜结构域；以及/n(c)胞内信号结构域，/n其中所述永生化T细胞系不表达至少一种内源性T细胞受体，并且不表达β2-微球蛋白(B2M)。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171213 US 62/5980321.一种表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化永生化T细胞系，所述CAR包含：
(a)包含抗原结合区的胞外结构域；
(b)跨膜结构域；以及
(c)胞内信号结构域，
其中所述永生化T细胞系不表达至少一种内源性T细胞受体，并且不表达β2-微球蛋白(B2M)。
2.根据权利要求1所述的永生化T细胞系，其中所述抗原结合区结合肿瘤相关抗原。
3.根据权利要求2所述的永生化T细胞系，其中所述肿瘤相关抗原是BCMA。
4.根据权利要求1所述的永生化T细胞系，其中所述抗原结合区结合III型纤连蛋白(FN3)结构域。
5.根据权利要求1所述的永生化T细胞系，其中所述至少一种内源性T细胞受体被敲除。
6.根据权利要求1所述的永生化T细胞系，其中所述至少一种内源性T细胞受体是TCR-α。
7.根据权利要求1所述的永生化T细胞系，其中所述至少一种内源性T细胞受体是KIR3DL2。
8.根据权利要求1所述的永生化T细胞系，其中B2M被敲除。
9.一种表达CAR的工程化TALL-104细胞系，所述CAR包含：
(a)包含抗原结合区的胞外结构域；
(b)跨膜结构域；以及
(c)胞内信号结构域，
其中所述TALL-104细胞系不表达至少一种内源性T细胞受体，并且不表达β2-微球蛋白(B2M)。
10.根据权利要求9所述的细胞系，其中所述抗原结合区结合肿瘤相关抗原。
11.根据权利要求10所述的细胞系，其中所述肿瘤相关抗原是BCMA。
12.根据权利要求9所述的细胞系，其中所述抗原结合区结合III型纤连蛋白(FN3)结构域。
13.根据权利要求9所述的细胞系，其中所述至少一种内源性T细胞受体被敲除。
14.根据权利要求9所述的细胞系，其中所述至少一种内源性T细胞受体是TCR-α。
15.根据权利要求9所述的细胞系，其中所述至少一种内源性T细胞受体是KIR3DL2。
16.根据权利要求9所述的细胞系，其中B2M被敲除。
17.一种表达CAR的工程化TALL-104细胞系，所述CAR包含：
(a)信号肽，所述信号肽具有SEQIDNO:3的氨基酸序列；
(b)胞外结构域，所述胞外结构域包含具有SEQIDNO:8-44中的任一者的氨基酸序列的FN3结构域；
(c)铰链区，所述铰链区具有SEQIDNO:4的氨基...
【专利技术属性】
技术研发人员：J李，J莫尼，M纳松，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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