本发明专利技术披露了一种制备抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在包含CD40L、ICOSL、ICOS和/或TLR激动剂的培养液中培养外周血单核细胞(PBMC)的步骤。本发明专利技术还提供一种诱导PBMC增殖、B细胞活化和分化和/或B细胞成熟的方法，涉及在含有IL2的培养液中培养PBMC的步骤。本发明专利技术还提供一种在产生抗体的PBMC中通过促进类别转换从而产生IgG的方法，该方法涉及在含有IL21的培养液中培养产生抗体的PBMC的步骤。
A new method of antibody preparation
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗体制备新方法专利
本专利技术主要涉及制备抗体的新方法，尤其是适用于制备全人源抗体的体外方法。专利技术背景抗体的制备方法在实验室和临床上都有广泛的应用。抗体制备过程中涉及杂交瘤技术、转基因动物模型和体外免疫法。传统的杂交瘤技术已经是被大多数人接受的主流成熟技术手段，通常包括动物免疫、淋巴细胞分离、淋巴细胞与骨髓瘤等永生化细胞融合、抗体人源化和亲和力成熟等步骤。抗体也可以通过高通量筛选的方法制备，但也面临着成本高、生产周期长、亲和力低、重链和轻链可变区配对不可预测等缺点。转基因动物模型是一种相对较新的技术，通过目前尚未明确的机制对动物进行基因改造，来表达人类的易变区域。近年来人们对体外免疫技术进行了深入研究和发展，使得该技术不再需要动物免疫，因而降低了其成本，操作更加方便快捷，无需任何人源化步骤即可获得全人源抗体，然而，鲜有用上述方法制备成功的抗体被报道。因此，继续需要研发新型高效的体外免疫方法来制备全人源抗体有重要意义。专利技术简述在一个方面，本专利技术提供了一种基于体外免疫手段制备抗体的新方法。在某些实施方案中，所述制备抗体或与抗原结合片段的方法都涉及一个步骤：用含有以下至少一种刺激剂的培养液培养外周血单核细胞(PBMC)：CD40配体(CD40L)、诱导性T细胞共刺激因子(Tcellco-stimulator,ICOS)、ICOS配体(ICOSL)、和/或Toll样受体(Toll-likeReceptor,TLR)激动剂。在某些实施方案中，所述制备抗体或抗原结合片段的方法涉及在同时含有CD40L和ICOSL的培养液中培养PBMC的步骤。在某些实施方案中，培养液还进一步含有IL2和/或IL21。在某些实施方案中，PBMC是从人的造血干细胞(HSCs)或脐带血分离出的。在某些实施方案中，PBMC包括B细胞和Tf细胞(Tfollicularcells)。在某些实施方案中，PBMC包括B细胞和树突状细胞(dendriticcells)。在某些实施方案中，PBMC包括B细胞、Tf和树突状细胞。在某些实施方案中，其中所述抗体或抗原结合片段是人源抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，其中所述抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，其中所述抗体或抗原结合片段可以是亲和力成熟抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、标记抗体、二价抗体或抗独特型抗体。重组抗体是用体外重组方法制备的抗体。本专利技术公布了与其他细胞因子或刺激剂(例如单独的CD40L)相比，使用本专利技术提供的体外免疫方法，CD40L、ICOSL、ICOS或TLR激动剂中的至少一种能够显著增加PBMC产生的抗体的产量。在某些实施方案中，TLR激动剂是TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9激动剂中的一种。在某些实施方案中，TLR激动剂是TLR7和TLR8(TLR7/8或TLR7/TLR8)激动剂。在某些实施方案中，TLR7激动剂是咪喹莫特(imiquimod)。在某些实施方案中，TLR9激动剂是CpG-ODN。在某些实施方案中，所述培养液包括ICOS和TLR激动剂。在某些实施方案中，所述培养液含有CD40L和TLR激动剂。在某些实施方案中，所述培养液含有ICOS和CD40L。在某些实施方案中，所述培养液含有ICOS、CD40L和TLR激动剂。在某些实施方案中，培养液进一步含有抗原。在培养开始，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21天或更长时间后，将抗原添加到培养液中。在某些实施方案中，抗原存在至少0.5天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、1个月或更长时间。在某些实施方案中，其培养液进一步含有刺激剂，包括但不限于共刺激分子(co-stimulators)、CpG-ODN2006(CpG-ODN)、白细胞介素(interleukins)、抗凋亡蛋白(anti-apoptoticproteins)、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactors,TNFs)、干扰素(interferons,INFs)、TLR配体、脂类(lipids)、avasimid、EFNB1、EPHB4、PlexinB2、Semaphorin4C，B淋巴细胞诱导成熟蛋白(B-lymphocyte-inducedmaturationprotein，BLIMP-1)、干扰素调节因子4(interferonregulatoryfactor4,IRF4)、抗原或其任何组合。在某些实施方案中，共刺激分子是CD40、CD40L、ICOS、ICOSL、增殖诱导配体(aproliferation-inducingligand，APRIL)、肿瘤坏死因子家族的B细胞激活因子(BAFF)、OX40、OX40配体(OX40L)或其任何组合。在某些实施方案中，CpGODN能够刺激Toll样受体9(TLR9)，包括但不限于CpGODN2006、D/KCpG或其任何组合。在某些实施方案中，白细胞介素包括但不限于IL2、IL21、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL13、IL14、IL15、IL33或其任何组合。在某些实施方案中，抗凋亡蛋白为Bcl-2、Bcl-6、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1及其类似物或其任何组合，其可通过本领域已知方法导入PBMC中，例如病毒感染。在某些实施方案中，抗体可以是抗人IgG或抗人IgM。在某些实施方案中，该培养液进一步含有Ephrin-B1前体(EFNB1)和/或激活诱导的胞苷脱氨酶(activation-inducedcytidinedeaminase，AICDA)。在某些实施方案中，刺激剂来自人类或非人类动物。在某些实施方案中，刺激剂在培养开始，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天后添加到培养液中。在某些实施方案中，将刺激剂在培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天后从培养液移除。在某些特定实例中，通过更换培养液或洗涤细胞的手段来去除。在某些实施方案中，CD40L、ICOSL、ICOS和TLR激动剂中的至少一种能诱导PBMC中的B细胞分化、和/或B细胞成熟来增强抗体产生。在某些实施方案中，该方法还进一步包含分离从培养的PBMC分泌的抗体的步骤。分离过程包括将产生抗体的PBMC与人骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞的步骤，或通过分离从人源性展示文库(例如噬菌体展示文库、酵母展示文库或哺乳动物细胞展示文库)中选择出的Fv克隆可变域基因序列。这样的可变域基因序列可通过技术操作连接到所需的人类恒定区基因序列，然后表达、获取以及从上清液中纯化抗体。在某些实施方案中，产生抗体的PBMC是B细胞。在某些实施方案中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在培养液中培养PBMC的步骤，所述培养液包含CD40L、ICOSL、ICOS和TLR激动剂中的至少一种。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170508 CN PCT/CN2017/083432;20180112 CN PCT/CN201.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在培养液中培养PBMC的步骤，所述培养液包含CD40L、ICOSL、ICOS和TLR激动剂中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养液包含ICOS和TLR激动剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养液包含CD40L和TLR激动剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养液包含ICOS和CD40L。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养液包含ICOS、CD40L和TLR激动剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养液进一步包含IL2和/或IL21。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述TLR激动剂是TLR7激动剂、TLR8激动剂或者TLR9激动剂。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述TLR激动剂是TLR7和TLR8(TLR7/TLR8)激动剂。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述TLR7激动剂是咪喹莫特(imiquimod)。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述TLR9激动剂是CpGODN。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述PBMC是从人中分离的，来自造血干细胞(HSC)或脐带血。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述PBMC包括B细胞和Tf细胞(Tfollicularcell)。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述PBMC包括B细胞和树突状细胞。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述PBMC包括B细胞、Tf细胞和树突状细胞。
15.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养液进一步包含抗原。
16.根据上述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述培养液还包括的共刺激分子、CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODNs)、白细胞介素、抗凋亡蛋白、TNFs、干扰素(INFs)、脂类、avasimid、EFNB1、EPHB4、PlexinB2、Semaphorin4C、BLIMP-1、IRF4或其任何组合。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述共刺激分子为CD40、APRIL、TNF家族的B细胞激活因子(BAFF)、OX40、OX40L或其任何组合。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述CpGODN是CpG2006、D/KCpG或其任何组合。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述白介素是IL-1b、IL2、IL21、IL4、IL3、IL5、IL6、IL7、IL10、IL13、IL14、IL15、IL33或其任何组合。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗凋亡蛋白为Bcl-2、Bcl-6、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1、其类似物或其任何组合。
21.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中CD40L、ICOSL、ICOS和TLR激动剂中的至少一种诱导PBMC产生抗体增强、PBMC中B细胞活化和分化和/或B细胞成熟。
22.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括从培养的PBMC中分离其分泌的抗体的步骤。
23.根据权利要求22所述的方法，其进一步包括获...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲁白，姚虹洋，郭炜，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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