用于诱导骨髓抑制细胞的组合物和方法以及其用途技术

提供了用于制造诱导性免疫调节细胞的组合物和方法，所述诱导性免疫调节细胞包括诱导性骨髓抑制细胞，所述诱导性骨髓抑制细胞包含MDSC(髓源性抑制细胞)、树突状细胞、巨噬细胞和其亚群。还提供了用于进一步修饰和调制所述诱导性免疫调节细胞以在治疗自身免疫性病症、血液恶性肿瘤、实体瘤、病毒感染、神经退行性病症、炎性病状或GvHD时获得增强的治疗潜能的方法和组合物。

Composition and method for inducing marrow suppressor cell and its application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于诱导骨髓抑制细胞的组合物和方法以及其用途相关申请本申请要求于2017年6月13日提交的美国临时申请序列号62/519,123的优先权，所述美国临时申请的公开内容通过全文引用的方式结合在此。
本公开广泛地涉及过继免疫细胞疗法领域。更具体地，本专利技术涉及经过改善的培养平台，所述经过改善的培养平台用于由包含人诱导性多能干细胞的多能干细胞制造适于过继细胞疗法的骨髓谱系的衍生调节性免疫细胞。
技术介绍
过继免疫疗法涉及向患有肿瘤、癌症、免疫病症或感染的患者施用免疫细胞，由此所施用的免疫细胞为患者提供治疗益处。一般而言，适于免疫疗法的免疫细胞包含但不限于B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT(自然杀伤T)细胞和造血干细胞或祖细胞。另外，免疫调节细胞(如髓源性抑制细胞(MDSC)、巨噬细胞和树突状细胞)是NK细胞、B细胞和T细胞的强效免疫调节剂并且在细胞疗法中特别关注调节免疫应答。这些基于细胞的免疫疗法的中心目标是在患者中介导完全且持久的疾病反应。MDSC是自然杀伤细胞、B细胞和T细胞的强效免疫调节剂。T细胞效应子功能的抑制通过多种机制发生，所述多种机制包含但不限于：PD-L1/PD1介导的无反应性、精氨酸酶1介导的L-精氨酸的耗竭、自由基物种的诱导型一氧化氮合酶和NADPH氧化酶的产生、半胱氨酸的吲哚胺2,3-双加氧酶螯合以及T调节细胞的扩增。通过MDSC在促进实体瘤的免疫抑制微环境中的关键作用强调了MDSC的免疫调节效力。这些特性表明，MDSC可以作为有效的细胞疗法来恢复免疫耐受，从而治疗包含移植物抗宿主病(GvHD)在内的免疫病症。在包含GvHD、炎症性肠病、1型糖尿病、系统性红斑狼疮和多发性硬化症在内的若干种鼠类疾病模型中，外源递送的MDSC被示出为减弱了免疫相关发病机制。然而，开发用于治疗免疫病症的患者来源的MDSC面临若干项挑战，包含MDSC的短缺和异质性、较差的可扩展性、高制造成本以及用于增强治疗属性的基因工程的有限选择。除其它免疫调节细胞外，利用hiPSC和衍生细胞(包含MDSC)用于治疗目的的主要障碍一直是需要在定义不确定的含血清培养基存在的情况下先将此类细胞与鼠源性或人源性基质细胞共培养以维持多能性并诱导分化。另外，现有方案还采用了由培养iPSC以形成胚状体(EB)组成的策略，所述胚状体是包括各种分化细胞(包含外胚层、中胚层和内胚层细胞)的异质细胞聚集体。这些程序需要例如通过旋转形成团块使多能细胞聚集、允许细胞在孔中沉淀和聚集、或者允许在悬浮培养时被动聚集并形成团块。在分化诱导培养系统中将形成的EB维持一定的持续时间(通常为七到十天)，以允许适当的分化，然后将EB转移到粘附培养以进一步成熟或者解离成单细胞以进行细胞类型选择，以便继续进行随后的分化步骤。(Kennedy等人,《细胞报告(CellReports)》2012:1722-1735；Knorr等人,《干细胞转化医学(StemCellsTranslationalMedicine)》2013(2):274-283)。例如，Kennedy等人教导了生成用于iPSC分化的EB，其中用胶原酶和胰蛋白酶处理多能细胞以允许刮除细胞从而形成小的聚集体，然后对所述小的聚集体进行培养以形成EB。已经示出了EB形成促进了多能干细胞分化，然而形成聚集体和随后的EB的要求是劳动密集型的，在此过程中细胞数量的增加最少，三维EB聚集体中的细胞含量不一致且不均匀地暴露于培养基因素，这产生了处于可变分化阶段的异质衍生细胞并且极大地阻碍了要求高效、一致且流线型的制造工艺的可扩展性和可重复性。另外，由于进入患者体内的细胞的最终状态，或者具体地说细胞亚型，在很大程度上可以通过制造工艺来定义，因此所述工艺的重要性无论怎样强调都不过分。优先地，维持或扩增具有期望的分化状态和/或适应性免疫细胞特征的细胞亚群会极为有益于增强基于细胞的疗法的功效。经过改善的细胞制造工艺具有多种潜在优势，包含缩短给药时间、提高细胞均匀性或增加达到期望剂量的患者百分比。另外，在制造工艺期间对细胞的功能改善，如归巢、增加的持久性和降低的毒性也可以使细胞疗法得到改善。因此，可以在数量和质量上均增强期望的免疫细胞亚群的制造方法可以显著地增强其治疗功效。本领域非常需要具有经过改善的治疗功效的免疫细胞亚群，并且需要分化干细胞以制造期望的免疫细胞而不依赖于共培养或含血清培养基并且无需形成胚状体聚集体作为中间体的方法和组合物。本专利技术的方法和组合物解决了这些需求并在免疫细胞治疗领域并且具体地说在免疫调节细胞方面提供了其它相关优势。
技术实现思路
在健康患者的外周血中MDSC(髓源性抑制细胞)缺失或极为罕见。虽然在某些条件下，可以通过早期骨髓祖细胞的分化过程由PBMC(外周血单核细胞)或CD34细胞生成有限数量的MDSC，但是这些方法并未产生足够数量的MDSC用于过继细胞疗法。本申请提供了一种产生临床上相关数量的MDSC的方法。具体地，本申请提供了用于制造诱导性免疫调节细胞的组合物和方法，所述诱导性免疫调节细胞包括诱导性骨髓抑制细胞，所述诱导性骨髓抑制细胞包含但不限于诱导性MDSC(iMDSC)和其亚群、诱导性树突状细胞以及诱导性巨噬细胞。还提供了用于进一步修饰和调制所述诱导性免疫调节细胞以在治疗如自身免疫性病症、血液恶性肿瘤、实体瘤、病毒感染、神经退行性疾病、炎性病状和疾病或GvHD等病状时获得增强的治疗潜能的方法和组合物。本专利技术的一方面提供了一种生成具有增强的治疗潜能的诱导性免疫调节细胞群的方法，并且所述方法通常包括：获得诱导性定形造血内皮细胞(iHE)；以及用包括ROCK抑制剂和MCSF以及任选的GMCSF的培养基组合物引导iHE的分化，从而生成包括诱导性骨髓抑制细胞的免疫调节细胞群。在一些实施例中，所述诱导性骨髓抑制细胞包括诱导性髓源性抑制细胞(iMDSC)、诱导性巨噬细胞和/或诱导性树突状细胞。在一些实施例中，所述iMDSC进一步包括不同的亚型，所述不同的亚型包括单核细胞MDSC、粒细胞MDSC和/或早期MDSC。在所述方法的一个实施例中，所述培养基组合物进一步包括(1)选自由IL1b、IL3、IL6、IL4、IL10、IL13、TGFβ、bFGF、VEGF、SCF和FLT3L组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选地，AhR拮抗剂和前列腺素途径激动剂中的一种或两种。在一个实施例中，如本文所公开的用于生成iMDSC群的培养基组合物包括ROCK抑制剂、MCSF、IL3、VEGF、bFGF、SCF和FLT3L。在一些实施例中，包括ROCK抑制剂、MCSF、IL3、VEGF、bFGF、SCF和FLT3L的所述培养基进一步包括IL1b、IL6、IL10和TGFβ中的一种或多种。在一些实施例中，所述培养基组合物不具有IL6。在一些实施例中，所述培养基组合物不需要TPO。在一些实施例中，所述培养基组合物进一步包括饲养细胞或饲养细胞组分。在一些实施例中，所述饲养细胞是OP9。在一些实施例中，所述饲养细胞是K562。在一些实施例中，所述饲养细胞过表达一种或多种支持衍生细胞的分化、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生成诱导性免疫调节细胞群的体外方法，其包括：/n(i)获得诱导性定形造血内皮细胞(iHE)；/n(ii)用包括ROCK抑制剂和MCSF的培养基组合物引导iHE的分化；/n从而生成包括诱导性骨髓抑制细胞的诱导性免疫调节细胞群，并且其中所述细胞群具有增强的治疗潜能。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170613 US 62/519,1231.一种生成诱导性免疫调节细胞群的体外方法，其包括：
(i)获得诱导性定形造血内皮细胞(iHE)；
(ii)用包括ROCK抑制剂和MCSF的培养基组合物引导iHE的分化；
从而生成包括诱导性骨髓抑制细胞的诱导性免疫调节细胞群，并且其中所述细胞群具有增强的治疗潜能。


2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括以下特征中的一个或多个：
a)其中所述培养基组合物进一步包括(1)选自由IL1b、IL3、IL6、IL4、IL10、IL13、TGFβ、bFGF、VEGF、SCF、GMCSF和FLT3L组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选地，(2)AhR拮抗剂和前列腺素途径激动剂中的一种或两种；
b)其中所述培养基组合物无饲养层和/或无血清；
c)其中诱导性骨髓抑制细胞群包括(1)诱导性髓源性抑制细胞(iMDSC)；(2)诱导性树突状细胞；和/或(3)诱导性巨噬细胞；
d)其中所述诱导性免疫调节细胞群包括以下的一个或多个亚群：(i)CD45+细胞；(ii)CD45+CD33+细胞；(iii)单核细胞MDSC(M-MDSC)；(iv)CD45+CD33+CD14+细胞；(v)CD45+CD33+PDL1+细胞；(vi)粒细胞MDSC(G-MDSC)；(vii)CD45+CD14-CD15+CD11b+细胞；(viii)CD45+CD206+细胞；以及(ix)CD45+CD11c+CD14-HLADRhigh细胞；
e)其中所述诱导性免疫调节细胞群包括以下中的至少一种：
(1)超过90％的iMDSC，其中所述iMDSC包括单核细胞MDSC；和/或
(2)超过20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的单核细胞MDSC和/或CD45+CD33+PDL1+细胞；其中所述单核细胞MDSC包括CD45+CD33+CD14+细胞；和/或
(3)超过20％、30％、40％或50％的粒细胞MDSC，其中所述粒细胞MDSC包括CD45+CD11b+CD14-CD15+细胞；和/或
(4)超过20％、30％、40％或50％的巨噬细胞；其中所述巨噬细胞包括CD45+CD206+细胞；和/或
(5)超过20％、30％、40％或50％的树突状细胞；其中所述树突状细胞包括CD45+CD11c+CD14-HLADRhigh细胞；
f)其中包括iMDSC的所述诱导性免疫调节细胞群基本上不含粒细胞、红细胞和/或淋巴样细胞；
g)其中包括在所述诱导性免疫调节细胞群中的所述诱导性骨髓抑制细胞包括由对所述诱导性骨髓抑制细胞进行基因工程化获得的一个或多个遗传印记；
h)其中包括在所述诱导性免疫调节细胞群中的所述诱导性骨髓抑制细胞包括从包括相同的一个或多个遗传印记的iHE中保留的一个或多个遗传印记；
i)其中所述iHE细胞衍生自诱导性多能干细胞(iPSC)、iPSC衍生的中胚层细胞或iPSC衍生的具有定形造血内皮潜能的中胚层细胞；并且任选地，所述iPSC包括其衍生细胞能够保留的一个或多个遗传印记；
j)其中所述ROCK抑制剂是噻唑维或Y27632；以及
k)其中所述增强的治疗潜能包括以下中的一种或多种：(1)所述诱导性免疫调节细胞群中诱导性MDSC的数量或比率增加；(2)抑制T细胞增殖和效应子功能的效力提高；以及(3)与包括在PBMC(外周血单核细胞)中的骨髓抑制细胞相比能够减弱GvHD。


3.根据权利要求2所述的方法，所述方法进一步包括以下特征中的一个或多个：
a)其中所述AhR拮抗剂包括StemRegenin1(SR1)；
b)其中iPSC的所述一个或多个遗传印记通过包括以下的方法获得：(i)获得具有供体特异性、疾病特异性或治疗反应特异性的源特异性免疫细胞，其中所述免疫细胞呈现出能保留的治疗属性；以及(ii)将所述源特异性免疫细胞重编程为iPSC；或通过包括在将非多能细胞重编程为iPSC期间或之后进行基因组编辑的方法获得，其中所述遗传印记包括通过所述iPSC的基因组中的基因组插入、缺失或取代引入的一种或多种遗传修饰模式；
c)其中所述方法进一步包括通过所述诱导性骨髓抑制细胞的基因组中的基因组插入、缺失或取代来对步骤(ii)的所述诱导性骨髓抑制细胞进行基因组编辑，以向所述细胞引入一种或多种遗传修饰模式；或
d)其中所述方法进一步包括通过接触一种或多种调制剂来调制步骤(ii)的所述诱导性骨髓抑制细胞，以增强所述细胞的治疗潜能。


4.根据权利要求3所述的方法，其中所述遗传修饰模式包括：
a)以下中的一种或多种：安全开关蛋白、靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药学活性蛋白和肽、药物靶标候选物；或促进所述诱导性骨髓抑制细胞或其所述亚群中的一个或多个亚群的植入、运输、归巢、生存力、自我更新、持久性、免疫应答调节和调制和/或存活的蛋白质；
b)嵌合受体、归巢受体、抗炎分子、免疫检查点蛋白、细胞因子/趋化因子诱饵受体、生长因子、改变的促炎性细胞因子受体、CAR或用于与双特异性或多特异性或通用接合剂偶联的表面触发受体的引入的或增加的表达；并且任选地，其中所述引入的或增加的表达由通过炎症信号传导调节的启动子驱动；和/或
c)共刺激基因的减少的或沉默的表达。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述方法具有以下特征中的一个或多个：
a)所述遗传修饰模式包括以下中的一种或多种：(i)B2M、TAP1、TAP2、TAP相关糖蛋白、NLRC5、RFXANK、CITTA、RFX5、RFXAP或在染色体6p21区域中的任何HLA基因的缺失或表达降低；(ii)引入或增加IDO1、PDL1、CTLA4、Arg1、IL35、I...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·A·帕龙，R·S·塔科，B·瓦拉梅尔，D·舒梅克，M·霍斯金，L·格雷塔兹，
申请(专利权)人：菲特治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US