【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】诱导性多能干细胞的改善的重编程、维持和保存
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2020年10月2日提交的美国临时申请序列号63/087,119的优先权,其公开内容据此全文以引用方式并入。
[0003]本公开广泛涉及产生人诱导性多能干细胞(iPSC或iPS细胞)的领域。更具体地,本公开涉及使用质粒载体的组合来以更高的效率和增加的可靠性获得具有期望特性的无足迹iPSC。
技术介绍
[0004]最初使用整合病毒系统表达关键转录因子来产生iPSC。逆转录病毒和慢病毒系统(包括多顺反子和诱导型系统)现在已经成功地用于iPSC产生。然而,由于插入诱变和iPSC分化后外源基因再活化的可能性引起的永久基因组变化可能对随后的药物筛选和通过这些方法产生的细胞的治疗应用提出潜在的问题。实际上,已经报道了使用相同病毒系统产生的iPSC克隆之间的显著差异,当作为分化的神经球移植时,啮齿动物中很大百分比的克隆形成肿瘤。研究表明,使用相同病毒方法产生的iPSC一旦分化就可能表现不同。异位基因整合位点的差异可导致转基因表达的不同插入诱变和表观遗传调控。对于包括整合系统的iPSC产生方法,可能需要衍生和筛选许多克隆以鉴定在多能和分化状态中均稳定的那些克隆。
[0005]在细胞疗法制造过程中的许多关键方面中,细胞扩增和深低温保藏已经被鉴定为所关注的关键领域,其中细胞活力和功能性在冻
‑
融循环期间受到极大影响,并且来源于iPSC分化的效应细胞的体内细胞功效和存留在iPSC分化后的效应细胞扩增阶段期间受到 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于诱导性多能干细胞(iPSC)产生的组合物,所述组合物包含:(i)TGFβ家族蛋白,(ii)ROCK抑制剂,和(iii)MEK抑制剂和WNT活化剂,其中所述组合物不包含TGFβ抑制剂,其中所述组合物在长期iPSC维持中有效地改善iPSC多能性和基因组稳定性。2.根据权利要求1所述的组合物,(a)其中所述长期iPSC维持包括一个或多个阶段,所述阶段包括:iPSC集落的单细胞解离、解离的iPSC的单细胞分选、iPSC单细胞克隆扩增、克隆iPSC主细胞库(MCB)深低温保藏、iPSCMCB的解冻和任选地所述iPSC MCB的附加深低温保藏
‑
解冻循环;或者(b)其中所述TGFβ家族蛋白任选地在iPSC集落的单细胞解离时,或在iPSC单细胞克隆扩增时,或在其间的任何阶段添加到所述组合物中;或者(c)其中所述MEK抑制剂和/或所述WNT活化剂的量为用于将非多能细胞重编程为所述iPSC的重编程组合物中使用的量的30%
‑
60%。3.根据权利要求1所述的组合物,(i)其中所述TGFβ家族蛋白包含激活素A、TGFβ、Nodal和其功能变体或片段中的至少一者;并且/或者(ii)其中所述WNT活化剂包括GSK3抑制剂。4.根据权利要求2所述的组合物,(i)其中所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞;或者(ii)其中所述非多能细胞包括T细胞;或者(iii)其中所述重编程组合物包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂、WNT活化剂、TGFβ抑制剂和任选的HDAC抑制剂,其中所述TGFβ抑制剂和所述HDAC抑制剂在重编程期间的特定阶段被包含在所述重编程组合物中。5.根据权利要求1所述的组合物,(i)其中与没有接触所述组合物的iPSC相比,所述改善的长期iPSC多能性通过减少的多能性逆转或减少的自发分化来指示;并且(ii)其中与没有接触所述组合物的iPSC相比,所述改善的基因组稳定性通过更低的基因组异常倾向来指示。6.根据权利要求5所述的组合物,其中所述改善的基因组稳定性包括减少或预防从对T细胞进行重编程获得的iPSC中的三体性或核型异常。7.根据权利要求1所述的组合物,所述组合物还包含iPSC,任选地其中所述iPSC包含至少一种基因组编辑。8.根据权利要求2所述的组合物,(i)其中所述iPSC维持还包括iPSC基因编辑以获得工程改造的iPSC池、工程改造的iPSC池的单细胞分选、工程改造的iPSC单细胞克隆扩增、克隆工程改造的iPSC主细胞库(MCB)深低温保藏、工程改造的iPSC MCB的解冻和任选地所述工程改造的iPSC MCB的附加深低温保藏
‑
解冻循环;并且
(ii)其中所述工程改造的iPSC包含至少一种基因组编辑。9.一种用于诱导性多能干细胞(iPSC)产生的组合物,所述组合物包含:(i)ROCK抑制剂、MEK抑制剂和WNT活化剂;(ii)HDAC抑制剂;和(iii)TGFβ抑制剂,其中所述组合物有效地改善非多能细胞的重编程以获得具有建立的多能性和改善的基因组稳定性的iPSC,并且任选地,其中,将(i)、(ii)或(iii)添加到所述组合物中在所述非多能细胞的重编程期间对于提高的重编程效率是阶段特异性的。10.根据权利要求9所述的组合物,(a)其中所述非多能细胞的所述重编程包括一个或多个阶段,所述阶段包括:体细胞转染(第0天)、外源基因表达、异染色质增加、体细胞身份丧失和iPSC集落形成;或者(b)其中所述HDAC抑制剂的所述添加任选地在染色质重组时,或在约第2
‑
3天(转染后);或者(c)其中所述TGFβ抑制剂的所述添加任选地在体细胞身份丧失时,或在约第6
‑
8天(转染后),其中重编程中的所述一个或多个阶段通过细胞形态学变化和/或标记基因谱来指示。11.根据权利要求9所述的组合物,(i)其中所述HDAC抑制剂包含丙戊酸(VPA)或其功能变体或衍生物;并且/或者(ii)其中所述WNT活化剂包括GSK3抑制剂。12.根据权利要求9所述的组合物,(i)其中所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞;或者(ii)其中所述非多能细胞包括T细胞。13.根据权利要求9所述的组合物,(i)其中所述建立的多能性包括基态多能性;并且/或者(ii)其中所述建立的多能性由增加的初始特异性基因表达表示,所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者:MAEL、KLF4、DNMT3L、DPPA5、PRDM14、FGF4、UTF1、TFCP2L1和TBX3;并且/或者(iii)其中所述改善的基因组稳定性通过比在重编程期间没有接触所述组合物获得的iPSC更低的基因组异常倾向来指示;并且/或者(iv)其中所述提高的重编程效率通过重编程后iPSC池中表达多能性标记基因的细胞的百分比高于在重编程期间没有接触所述组合物获得的所述iPSC池的表达多能性标记基因的细胞的百分比来指示。14.一种产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法,所述方法包括对iPSC群体进行深低温保藏的步骤,其中所述iPSC与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触,并且其中所述iPSC的多能性和基因组稳定性在深低温保藏期间得以维持;并且任选地,其中包含同质iPSC的所述iPSC群体从克隆iPSC单细胞扩增。15.根据权利要求14所述的方法,所述方法还包括将单细胞iPSC克隆扩增以获得所述
克隆iPSC群体的步骤,其中所述iPSC与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触,并且其中所述iPSC的多能性和基因组稳定性在扩增期间得以维持。16.根据权利要求15所述的方法,所述方法还包括对解离的iPSC进行单细胞分选以获得单细胞iPSC克隆的步骤,其中所述iPSC与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触,并且其中所述iPSC的多能性和基因组稳定性在单细胞分选期间得以维持。17.根据权利要求16所述的方法,所述方法还包括将iPSC集落解离成单细胞iPSC的步骤,其中所述iPSC与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触,并且其中所述iPSC的多能性和基因组稳定性在iPSC单细胞解离期间得以维持。18.根据权利要求17所述的方法,所述方法还包括获得至少一个包含由对非多能细胞进行重编程产生的iPSC的集落的步骤。19.根据权利要求14至18中任一项所述的方法,其中所述iPSC从体细胞、祖细胞或多潜能细胞重编程,或者其中所述iPSC从T细胞重编程。20.根据权利要求14至19中任一项所述的方法,(i)其中所述多能性包括基态多能性;并且/或者(ii)其中所述多能性由增加的初始特异性基因表达表示,所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者:MAEL、KLF4、DNMT3L、DPPA5、PRDM14、FGF4、UTF1、TFCP2L1和TBX3;并且/或者(iii)其中所述基因组稳定性包括比在没有接触所述组合物的所述步骤中的iPSC更低的基因组异常倾向。21.一种产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法,其中所述方法包括:(i)将一种或多种重编程因子转移至非多能细胞以启动所述细胞的重编程;以及(ii)使步骤(i)后的所述细胞与根据权利要求9至13中任一项所述的组合物接触足够长的时间,从而通过对所述非多能细胞进行重编程来产生至少一个包含iPSC的集落。22.根据权利要求21所述的方法,其中所述转移步骤包括向所述非多能细胞中引入:(i)一个或多个第一质粒,其中所述第一质粒中的每个第一质粒包含复制起点和编码一种或多种重编程因子的多核苷酸,但不包含编码EBNA或其变体的多核苷酸;其中所述一个或多个第一质粒共同包含编码至少OCT4,或至少OCT4、YAP1、SOX2和大T抗原(LTag)的多核苷酸;其中一个或多个第一质粒的所述引入诱导重编程过程;以及(ii)以下项中的一者:(1)包含编码EBNA的核苷酸序列的第二质粒,其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸;(2)EBNA mRNA;和(3)EBNA蛋白。23.根据权利要求22所述的方法,其中所述一个或多个第一质粒还共同包含编码SOX2和KLF中的一者或两者,或MYC、LIN28、ESRRB和ZIC3中的一者或多者的多核苷酸。24.根据权利要求21所述的方法,其中所述接触步骤还包括在ROCK抑制剂、MEK抑制剂、WNT活化剂、HDAC抑制剂和TGFβ抑制剂的存在下培养所述细胞。25.根据权利要求21所述的方法,其中所述接触步骤包括:(a)任选地在外源重编程因子表达阶段,或在重编程因子转移(第0天)后第1
‑
2天使步
骤(i)后的所述细胞与包含ROCK抑制剂、MEK抑制剂和WNT活化剂的组合接触;(b)任选地在染色质重组阶段,或在重编程因子转移后约第2
‑
3天使步骤(a)的所述细胞与HDAC抑制剂接触;以及(c)任选地在体细胞身份丧失阶段,或在约第6
‑
8天(转染后)使步骤(b)的所述细胞与TGFβ抑制剂接触,从而产生至少一个包含iPSC的集落;其中所述阶段通过细胞形态变化和/或标记基因谱来指示;并且/或者其中所述iPSC是无足迹的,具有建立的多能性和改善的基因组稳定性,并且与没有步骤(a)、(b)和(c)的重编程相比以更高的效率产生。26.根据权利要求21所述的方法,(i)其中所述非多能细胞包括体细胞、祖细胞或多潜能细胞;或者(ii)其中所述非多能细胞包括T细胞。27.根据权利要求25所述的方法,(i)其中所述建立的多能性包括基态多能性;并且/或者(ii)其中所述建立的多能性由增加的初始特异性基因表达表示,所述增加的初始特异性基因表达包括以下中的一者或多者:MAEL、KLF4、DNMT3L、DPPA5、PRDM14、FGF4、UTF1、TFCP2L1和TBX3;并且/或者(iii)其中所述改善的基因组稳定性包括比来自没有步骤(a)、(b)和(c)的重编程的iPSC更低的基因组异常倾向;并且/或者(iv)其中所述提高的重编程效率通过重编程后iPSC池中表达多能性标记基因的细胞的百分比高于在重编程期间没有接触所述组合物获得的iPSC池的表达多能性标记基因的细胞的百分比来指示。28.根据权利要求26所述的方法,其中所述改善的基因组稳定性还包括减少或预防从对T细胞进行重编程获得的iPSC中的三体性或核型异常。29.一种产生诱导性多能干细胞(iPSC)的方法,其中所述方法包括:(i)将一种或多种重编程因子转移至非多能细胞以启动所述细胞的重编程;(ii)使步骤(i)后的所述细胞与根据权利要求9至13中任一项所述的组合物接触足够长的时间,从而产生至少一个包含iPSC的集落,其中建立所述iPSC的多能性和基因组稳定性;(iii)将步骤(ii)的所述iPSC集落解离成解离的iPSC,其中所述iPSC与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触;(iv)对解离的iPSC进行分选以获得一个或多个单细胞iPSC克隆,其中所述单细胞iPSC克隆与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触;以及任选地,(v)将所述单细胞iPSC克隆扩增成克隆iPSC群体,其中所述克隆iPSC群体与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触;以及任选地(vi)对所述克隆iPSC群体进行深低温保藏,其中所深低温保藏的群体与根据权利要求1至8中任一项所述的组合物接触;其中所述iPSC的多能性和基因组稳定性在所述解离、分选、扩增、深低温保藏或解冻的
步骤期间得以维持。30.根据权利要求29所...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。