用于宫内膜再生细胞分离、培养及冻存的方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种用于体外提取及扩增宫内膜再生细胞的方法，以及利用该方法的试剂盒，实现了ERC的高效分离、扩增，为ERC细胞临床研究提供了稳定、大量的细胞来源。大量的细胞来源。大量的细胞来源。

【技术实现步骤摘要】
用于宫内膜再生细胞分离、培养及冻存的方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及干细胞培养
，具体地说涉及一种用于体外提取及扩增宫内膜再生细胞的方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]女性子宫内膜在每个月经期都会有组织和血管大量增长，这一增长过程会随着月经周期的结束而停止。美日中等多国科学家的研究显示，随女性经血脱落的子宫内膜组织中具有相当数量的间充质干细胞——子宫内膜再生细胞(ERC)，是成体干细胞的一种，来源于子宫内膜基底层周期性的脱落(即女性经血)，受到广泛关注和研究。与其他来源的间充质干细胞比较，ERC具有来源丰富(20
‑
45岁健康女性皆可提供)、理论上ERC可从子宫切除、诊断性刮宫和妊娠早期蜕膜等多种组织中获取，但最理想的采集方式还是在月经期间使用月经杯收集经血中的子宫内膜，这样不会对捐赠者造成任何侵入性的伤害、易分离培养、传代次数较多、低免疫原性、无伦理争议、并且具有多向分化潜能等特点。
[0003]同时，在疾病治疗中的研究表明，ERC于临床疾病中的应用也十分广泛。如心血管疾病(心肌梗死)、急性肺损伤、肝脏疾病(肝脏纤维化)、I型糖尿病、神经系统疾病(缺血性脑卒中、阿尔茨海默症)、杜氏肌肉萎缩症、严重肢体缺血症、妇科相关疾病(卵巢早衰、子宫腔粘连、子宫内膜异位症、盆腔脏器脱垂)、皮肤创伤等疾病治疗中都取得了一定进展。从现有的研究来看，以ERC为基础的各种疾病治疗相关临床前或临床研究，均未发现明显的不良反应。目前，关于ERC细胞的研究也越来越受到重视，如何能够快速高效的获取一定数量的ERC细胞仍是需要解决的一个重要问题。

技术实现思路

[0004]为此，本专利技术正是要解决上述技术问题，从而提供一种用于ERC细胞分离、培养及冻存的方法及试剂盒，能够满足从月经血中快速提取ERC细胞的目的。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为：
[0006]本专利技术提供一种ERC细胞分离、培养及冻存的方法及试剂盒，试剂盒中包括如下组分：经血采集套装、细胞培养套装、细胞冻存套装；
[0007]其中，经血采集套装包括：
[0008]经血采集杯(1个)；
[0009]30ml经血保存液(2支)；
[0010]作为优选，所述经血保存液采用培养基、青链双抗、两性霉素及肝素钠按一定比例配制而成。
[0011]作为优选，所述培养基为F
‑
12培养基。
[0012]作为优选，所述青链双抗为Gibco
TM
Penicillin
‑
Streptomycin，其中青霉素浓度为50
‑
100U/ml，链霉素浓度为50
‑
100ug/ml。
[0013]作为优选，所述两性霉素为阿拉丁两性霉素B，浓度为0.1
‑
0.5mg/ml。
[0014]作为优选，所述经血保存液置于试剂瓶保存，所述试剂瓶均为一次性无菌、无热源西林瓶。
[0015]其中，细胞培养套装包括：
[0016]细胞培养液A，细胞培养添加物B，细胞培养添加物C，细胞培养添加物D，细胞培养添加物E，细胞分离液，细胞清洗液，细胞消化液。
[0017]作为优选，细胞培养液A为MSCGM
‑
CD
TM
BulletKit，货号：00190632；
[0018]作为优选，细胞培养添加物B为尿苷，使用浓度为1μM～100μM；作为优选，所述细胞培养添加物B为尿苷，使用浓度为1，5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μM；
[0019]作为优选，细胞培养添加物C为PALL
TM Ultroser G血清替代品，货号：15950
‑
017，使用浓度为2％
‑
5％；
[0020]作为优选，细胞培养添加物D为组胺，使用浓度为10
‑6mol/L～10
‑9mol/L；所述细胞培养添加物D为组胺，使用浓度为10
‑6，10
‑7，10
‑8，10
‑9mol/L
[0021]作为优选，细胞培养添加物E为Gibco
TM
Penicillin
‑
Streptomycin
‑
Glutamine，货号：10378016，使用浓度为1％；
[0022]作为优选，细胞清洗液为Gibco
TM
DPBS，货号：14190250；
[0023]作为优选，细胞消化液为Gibco TM
0.25％ Trypsin，货号：15050065；
[0024]其中，细胞冻存套装包括：
[0025]细胞冻存液A：90％ MSCGM
‑
CD
TM
Ultroser G；
[0026]细胞冻存液B：50％DMSO+50％右旋糖酐；
[0027]优选地，冻存工作液为50
‑
80％细胞冻存液A+20
‑
50％细胞冻存液B；
[0028]作为优选，冻存工作液为80％细胞冻存液A+20％细胞冻存液B；
[0029]本专利技术所述的用于ERC分离、培养、储存的试剂盒使用方法，包括以下步骤：
[0030]1)采用采集套装采集女性经期的月经血：
[0031]a.将无菌经血采集杯置于阴道内，收集4
‑
6小时；
[0032]b.取出，将收集的经血置于经血保存液内，运输至实验室进行处理；
[0033]2)经血处理及ERC培养：
[0034]a.血样用筛网过滤到两个50ml洁净离心管中，在500g的条件下将滤液离心10分钟。
[0035]b.缓慢将过滤后的血样加入至15ml淋巴细胞分离液上层。
[0036]c.离心机设置700g、20min、升速3、降速3，离心完毕，获取白膜层单个核细胞。
[0037]d.加入清洗液至50mL，离心洗涤。
[0038]e.吸取9mL完全培养液加至离心管中，吹打混匀，转至T25培养瓶。
[0039]作为优选，所述完全培养液为500ml细胞培养液A(MSCGM
‑
CD
TM
BulletKit)含终浓度为1μM～100μM的细胞培养添加物B(尿苷)、10ml细胞培养添加物C(PALL
TM Ultroser G血清替代品)、终浓度为10
‑6mol/L～10
‑9mol/L的细胞培养添加物D(组胺)5ml细胞培养添加物E(Gibco
TM
Penicillin
‑
Streptomycin
‑
Glutamine)
[0040]f.将培养瓶放入37℃，5％ CO2培养箱中培养；
[0041]g.待细胞融合度达到80本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于体外提取及扩增子宫内膜再生细胞(ERC)的试剂盒，其特征在于，包括：经血采集套装、细胞培养套装、细胞冻存套装。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述经血采集套装包括：经血采集杯、经血保存液；优选的，所述经血保存液采用培养基、青链双抗、两性霉素及肝素钠按一定比例配制而成。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述培养基为F
‑
12培养基，所述青链双抗为Gibco
TM
Penicillin
‑
Streptomycin，所述两性霉素为阿拉丁两性霉素B。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞培养套装包括：细胞培养液A，细胞培养添加物B，细胞培养添加物C，细胞培养添加物D，细胞培养添加物E，细胞分离液，细胞清洗液，细胞消化液。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞培养液A为MSCGM
‑
CD
TM
BulletKit，货号：00190632；作为优选，所述细胞培养添加物B为尿苷，使用浓度为1μM～100μM；作为优选，所述细胞培养添加物B为尿苷，使用浓度为1，5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μM；作为优选，所述细胞培养添加物C为PALL
TM Ultroser G血清替代品，货号：15950
‑
017；作为优选，所述细胞培养添加物D为组胺，使用浓度为10
‑6mol/L～10
‑9mol/L；作为优选，所述细胞培养添加物D为组胺，使用浓度为10
‑6，10
‑7，10
‑8，10
‑9mol/L；作为优选，所述细胞培养添加物E为Gibco
TM
Penicillin
‑
Streptomycin
‑
Glutamine，货号：10378016；作为优选，所述细胞清洗液为Gibco
TM
DPBS，货号：14190250；作为优选，所述细胞消化液为Gibco
TM

【专利技术属性】
技术研发人员：马冬磊，王蕾，李明明，申阳，张佳玲，
申请(专利权)人：安徽易文赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：