肠道干细胞及其在改善肠道微环境以及抗肠道衰老中的应用制造技术

本申请公开了一种肠道干细胞及其在制备改善肠道微环境以及抗肠道衰老制剂中的应用。该肠道干细胞包括表达Lgr5的肠道干细胞和表达Bim1的肠道干细胞，并经过WB检测和mRNA水平检测，发现二者的P2代细胞还分别表达了c

【技术实现步骤摘要】
肠道干细胞及其在改善肠道微环境以及抗肠道衰老中的应用


[0001]本申请涉及肠道微环境
，尤其涉及肠道干细胞及其在改善肠道微环境以及抗肠道衰老中的应用。

技术介绍

[0002]在机体衰老过程中，肠道干细胞的自我更新和多向分化潜能会发生改变。研究发现，老年人小肠上皮干细胞的子代细胞呼吸链缺陷导致其增殖减少、凋亡增加7。而且机体衰老过程中肠道不同类型的上皮细胞数量会发生改变，但在不同的物种、不同的肠道部位，发生的变化不同。Sandstrom等Dz
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isl研究发现，老年人十二指肠和衰老小鼠的大肠内分泌细胞数量增加，但老年人直肠的内分泌细胞数量并未发生变化。
[0003]目前关于肠道衰老过程中微环境的研究主要集中于平滑肌细胞、间质细胞、肠神经细胞及淋巴细胞。衰老过程中肠道的消化吸收功能、免疫屏障功能等的改变与肠道微环境细胞变化紧紧相关，然而由于肠道系统的复杂性，衰老过程中所发生的变化仍有待进一步研究。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本申请的目的在于至少提供一种用于缓解或者改善衰老过程中肠道微环境相关因素的制剂，以期在该领域的应用中提高新的解决方法。
[0005]第一方面，本申请实施例公开了一种肠道干细胞的传代培养方法，包括以下步骤：
[0006]分离得到表达Lgr5的肠道干细胞和表达Bim1的肠道干细胞，所述表达Lgr5的肠道干细胞和所述表达Bim1的肠道干细胞均来自于十二场上皮组织；
[0007]将所述表达Lgr5的肠道干细胞和所述表达Bim1的肠道干细胞分别于原代培养液和传代培养液进行传代培养，传代次数不超过4代，每次代培养时间不超过48h。
[0008]在本申请实施例中，用于培养所述表达Lgr5的肠道干细胞的原代培养液为含10～20mM HEPES、5～10mM谷氨酰胺、0.2～2倍N2细胞培养添加剂、0.2～2mg/mL CD Feed 002、80～100U/mL青霉素、80～100mg/mL链霉素、2～5μg/mL转铁蛋白、10～20μg/mL胰岛素、0.10～0.25mM非必需氨基酸、0.2～1mM丙酮酸钠的DMEM/F12培养基；用于传代培养所述表达Lgr5的肠道干细胞的传代培养液为含8～15mM HEPES、3～8mM谷氨酰胺、0.2～1mg/mL CD Feed 002、80～100U/mL青霉素、80～100mg/mL链霉素、2～5μg/mL转铁蛋白、10～20μg/mL胰岛素、0.10～0.25mM非必需氨基酸、0.2～1丙酮酸钠的DMEM/F12培养基。
[0009]在本申请实施例中，用于培养所述表达Bim1的肠道干细胞的原代培养液为含10～20mM HEPES、5～10mM谷氨酰胺、0.5～2mg/mL CD Feed 002、80～100U/mL青霉素、80～100mg/mL链霉素、2～5μg/mL转铁蛋白、10～20μg/mL胰岛素、0.10～0.25mM非必需氨基酸、0.2～1mM丙酮酸钠的DMEM/F12培养基；用于培养所述表达Bim1的肠道干细胞的传代培养液为含5～10mM HEPES、2～6mM谷氨酰胺、0.1～0.5mg/mL CD Feed 002、50～80U/mL青霉素、50～80mg/mL链霉素、2～5μg/mL转铁蛋白、10～20μg/mL胰岛素、0.10～0.25mM非必需氨基
酸、0.2～1mM丙酮酸钠的DMEM/F12培养基。
[0010]第二方面，本申请实施例公开了一种细胞制剂，包含第一方面所述的传代培养方法制得的表达Lgr5的肠道干细胞和表达Bim1的肠道干细胞；所述表达Lgr5的肠道干细胞和所述表达Bim1的肠道干细胞均高表达c
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Myc
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F、Sox9和MSI1基因。
[0011]第三方面，本申请实施例公开了一种改善肠道微环境以及抗肠道衰老的制剂，包括分别独立包装的Lgr5细胞制剂和Bim1细胞制剂，Lgr5细胞制剂包含不低于106个/mL的表达Lgr5的肠道干细胞以及其他药学上维持细胞活力的相关保护剂，Bim1细胞制剂包含不低于106个/mL的表达Bim1的肠道干细胞以及其他药学上维持细胞活力的相关保护剂；
[0012]其中，所述表达Bim1的肠道干细胞和所述表达Lgr5的肠道干细胞由第一方面所述的传代培养方法得到；所述表达Lgr5的肠道干细胞和所述表达Bim1的肠道干细胞均高表达c
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Myc
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F、Sox9和MSI1基因。
[0013]在本申请实施例中，施用该制剂时，Lgr5细胞制剂与Bim1细胞制剂的施用比例为(2～5):1。
[0014]在本申请实施例中，所述药学上维持细胞活力的相关保护剂包括50～80U/mL青霉素、50～80mg/ml链霉素、0.5～2mg/ml庆大霉素、0.5～2mg/mL两性霉素B、0.1～0.5μg/mL转铁蛋白、0.05～0.2μg/mL胰岛素、0.01～0.05mM非必需氨基酸、0.01～0.05mM丙酮酸钠、20～30wt％的基质胶和50～60wt％的甘油。
[0015]在本申请实施例中，该制剂还包括独立包装的促进制剂，所述促进制剂包含5～20ng/mL小鼠SF20因子、1～5ng/mL重组ErbB3(ErbB3
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f)和50～60wt％的甘油。
[0016]在本申请实施例中，施用该制剂时，Lgr5细胞制剂、Bim1细胞制剂和促进制剂的施用比例为(200～500):100:(1～5)。
[0017]第四方面，本申请实施例还公开了第一方面的传代培养方法得到的肠道干细胞、或第二方面的细胞制剂在制备改善肠道微环境以及抗肠道衰老制剂中的应用。
[0018]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
[0019]本申请从小鼠十二指肠上皮组织中提取相关细胞，并进行干细胞分离得到表达Bim1的干细胞和表达Lgr5的干细胞，并经过WB检测和mRNA水平检测，发现二者的P2代细胞还分别表达了c
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Myc
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F、Sox9和MSI1，这些基因分别作为肠道增值分化的转录因子和维持小肠干细胞稳态和修复能力发挥重要作用。由此说明，分离得到的表达Bim1的干细胞和表达Lgr5的干细胞具有维持小肠隐窝增殖和正常稳态，以及其损伤修复能力上的突出优势。
[0020]另外，本申请以上述分离得到的表达Bim1的干细胞和表达Lgr5的干细胞，制得了一种改善肠道微环境以及抗肠道衰老的制剂，并通过体内试验证实了其对于老龄小鼠的肠道微环境改善作用和对抗衰老相变基因表达的趋势，改善小鼠肠道分化功能缺陷，使得其肠道微环境向益生方向改善。
附图说明
[0021]图1为本申请实施例提供的小鼠十二指肠原代干细胞。
[0022]图2为本申请实施例提供的原代Lgr5细胞的染色图。
[0023]图3为本申请实施例提供的原代Bim1细胞的染色图。
[0024]图4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肠道干细胞的传代培养方法，包括以下步骤：分离得到表达Lgr5的肠道干细胞和表达Bim1的肠道干细胞，所述表达Lgr5的肠道干细胞和所述表达Bim1的肠道干细胞均来自于十二场上皮组织；将所述表达Lgr5的肠道干细胞和所述表达Bim1的肠道干细胞分别于原代培养液和传代培养液进行传代培养，传代次数不超过4代，每次代培养时间不超过48h。2.根据权利要求1所述的传代培养方法，其特征在于，用于培养所述表达Lgr5的肠道干细胞的原代培养液为含10～20mM HEPES、5～10mM谷氨酰胺、0.2～2倍N2细胞培养添加剂、0.2～2mg/mL CD Feed 002、80～100U/mL青霉素、80～100mg/mL链霉素、2～5μg/mL转铁蛋白、10～20μg/mL胰岛素、0.10～0.25mM非必需氨基酸、0.2～1mM丙酮酸钠的DMEM/F12培养基；用于传代培养所述表达Lgr5的肠道干细胞的传代培养液为含8～15mM HEPES、3～8mM谷氨酰胺、0.2～1mg/mL CD Feed 002、80～100U/mL青霉素、80～100mg/mL链霉素、2～5μg/mL转铁蛋白、10～20μg/mL胰岛素、0.10～0.25mM非必需氨基酸、0.2～1丙酮酸钠的DMEM/F12培养基。3.根据权利要求1所述的传代培养方法，其特征在于，用于培养所述表达Bim1的肠道干细胞的原代培养液为含10～20mM HEPES、5～10mM谷氨酰胺、0.5～2mg/mL CD Feed 002、80～100U/mL青霉素、80～100mg/mL链霉素、2～5μg/mL转铁蛋白、10～20μg/mL胰岛素、0.10～0.25mM非必需氨基酸、0.2～1mM丙酮酸钠的DMEM/F12培养基；用于培养所述表达Bim1的肠道干细胞的传代培养液为含5～10mM HEPES、2～6mM谷氨酰胺、0.1～0.5mg/mL CD Feed 002、50～80U/mL青霉素、50～80mg/mL链霉素、2～5μg/mL转铁蛋白、10～20μg/mL胰岛素、0.10～0.25mM非必需氨基酸、0.2～1mM丙酮酸钠的DMEM/F12培养基。4.一种细胞制剂，包含由权利要求1～...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫田秀明，
申请(专利权)人：广东格林邦卡新材料生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：