自体干细胞制剂、其制备方法及其在制备提高免疫力和修复机体组合物中的应用技术

本申请涉及干细胞技术领域，尤其涉及自体干细胞制剂、其制备方法及其在制备提高免疫力和修复机体组合物中的应用。该干细胞制剂包含骨髓基质干细胞，该骨髓基质干细胞高表达骨保护蛋白、Runx2和CCR7基因，不表达CXCL13基因。该骨髓基质干细胞能够于体外促进B细胞增殖和IL

【技术实现步骤摘要】
自体干细胞制剂、其制备方法及其在制备提高免疫力和修复机体组合物中的应用


[0001]本申请涉及干细胞
，尤其涉及自体干细胞制剂、其制备方法及其在制备提高免疫力和修复机体组合物中的应用。

技术介绍

[0002]再生自体干细胞具有再生和器毛吞噬的功能。可通过再生组织、神经使骨骼、肌肉组织、牙齿等恢复功能，自体干细胞还可吞噬肿瘤、增生骨骼和赘生物，起到人体康复的作用。自体再生骨髓基质干细胞和胚胎源性间充质干细胞具有强大的增殖能力和多向分化的潜能，以及大量扩增的特性，在适宜的体内环境下可分化为多种组织的能力。
[0003]骨髓基质干细胞除了具有较低的免疫原性外(低表达HLA
‑
I类分子，不表达HLA
‑
II类分子)，还具有调节免疫活性细胞反应的作用，MSC除了能抑制T细胞由丝裂原刺激的增殖反应，增加调节性T细胞比例外，还可以促进B细胞的增殖、活化以及其抗体分泌，并影响B细胞的趋化功能。
[0004]尽管现有几种已有大量关于骨髓基质干细胞的应用，然而其对于机体修复和免疫力提升应用研究较少，对于其移植机体后进行修复产生炎症排除反应也不能有效解决。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本申请的目的在于提供一种新型的骨髓基质干细胞以及其制备方法，以其一定程度上解决上述技术问题。
[0006]第一方面，本申请实施例公开了一种骨髓基质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0007]获得原代骨髓基质干细胞；
[0008]传代培养所述原代骨髓基质干细胞，获得第3代骨髓基质干细胞；
[0009]二维培养所述第3代骨髓基质干细胞，得到第一细胞；
[0010]以及三维培养所述第一细胞，得到第二细胞，所述第二细胞即为最终细胞。
[0011]在本申请实施例中，所述传代培养的步骤具体包括：
[0012]将原代骨髓基质干细胞，用0.125％胰酶消化分离后，接种至无血清培养液使得BMSCs在培养体系中的初始浓度不低于105个/mL，于37℃、5％CO2条件间震荡培养，培养过程中隔2～4日换液一次，直至贴壁细胞彼此融合，铺满培养瓶底，再重复以上操作，传至第3代。
[0013]在本申请实施例中，所述二维培养的步骤具体包括：
[0014]将二维薄膜贴敷于培养孔板中，再于每个孔板上倒入所述无血清液体培养液，同时接种所述第3代骨髓基质干细胞，并使得每孔中细胞浓度不低于105个/mL，培养7～9天。
[0015]在本申请实施例中于，所述二维薄膜为再生蚕丝素膜。
[0016]在本申请实施例中，所述二维培养中，每培养2日，全量换液，同时在换液后接种新鲜的所述第3代骨髓基质干细胞，同时并使得每孔中细胞浓度不低于105个/mL。
[0017]在本申请实施例中，所述三维培养的步骤包括：
[0018]取所述第一细胞，用0.125％胰酶消化分离后再用所述无血清培养液调整浓度至不低105个/mL，分别接种于上述三维支架中，37℃、5％CO2条件培养外培养2周，即可得到所述第二细胞。
[0019]在本申请实施例中，所述三维支架为胶原蛋白水凝胶。
[0020]第二方面，本申请实施例公开了第一方面所述的制备方法制得的骨髓基质干细胞，高表达骨保护蛋白、Runx2和CCR7基因，不表达CXCL13基因。
[0021]第三方面，本申请实施例公开了一种自体干细胞制剂，包含第二方面所述的骨髓基质干细胞。
[0022]第四方面，本申请实施例公开了第三方面所述的自体干细胞制剂在制备提高免疫力和修复机体组合物中的应用。
[0023]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
[0024]本申请实施例通过分离来自SPF级新西兰大白兔的BMSCs原代细胞，并对该原代细胞进行传代、二维和三维培养，得到一种能够高表达骨保护蛋白、Runx2和CCR7，不表达CXCL
‑
13的骨髓基质干细胞。该骨髓基质干细胞能够于体外促进B细胞增殖和IL
‑
10的分泌，下调与之共培养后的CD19
+
B细胞对CD4
+
T细胞数量以及IFN
‑
γ的分泌，具有一定的免疫抑制作用。
[0025]本申请实施例进一步通过将来源于SPF级新西兰大白兔的体外培养得到的骨髓基质干细胞移植其骨髓损伤模型大白兔自身机体中，发现其对损伤大白兔的运动能力具有修复作用，并且能够减轻移植后的急性排斥反应。
附图说明
[0026]图1为本申请实施例提供的原代骨髓基质干细胞显微图。
[0027]图2为本申请实施例提供的第3代骨髓基质干细胞显微图。
[0028]图3为本申请实施例提供的第一细胞显微图。
[0029]图4为本申请实施例提供的三维支架电镜图。
[0030]图5为本申请实施例提供的三维支架与第二细胞融合电镜图。
[0031]图6为本申请实施例提供的第二细胞显微图。
具体实施方式
[0032]为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
[0033]骨髓基质干细胞(BMSCs)的分离以及体外扩增
[0034]一、实验方法与材料
[0035]1、细胞来源
[0036]SPF级新西兰大白兔，8～9周龄，可达1.8kg左右，购自上海甲干生物科技有限公司。
[0037]2、原代兔骨髓基质干细胞的取材及分离培养
[0038]采用空气栓塞的方式将新西兰大白兔处死，消毒后取出两侧的股骨，选择肝素生理盐水进行冲洗，收集冲洗水，800rpm离心3min，去除上清液，用LG
‑
DMEM培养液重悬沉淀物，于37℃、5％CO2条件下培养，每3天换液1次，待细胞生长至融合度至80％以上时进行传代。对倒置相差显微镜逐日观察如图1所示。
[0039]3、BMSCs传代及体外扩增
[0040](1)传代培养
[0041]原代培养的贴壁细胞，可用0.125％胰酶将贴壁细胞消化分离，37℃处理2～5min，然后接种至含有20μg/mL鹿瓜多肽(注射用鹿瓜多肽，规格8mg，黑龙江江世药业有限公司，国药准字H20050950)、50μg/mL甲壳低聚糖表面活性剂的无血清McCoy
′
s 5A液体培养基(货号FK
‑
GP00703，樊克公司)，使得BMSCs在培养体系中的初始浓度不低于105个/mL，于T75方瓶中37℃、5％CO2条件间震荡培养。其中，甲壳低聚糖表面活性剂参照文献“甲壳低聚糖表面活性剂的制备及其表面活性研究[J]，功能高分子学报，2003年12月公开”的方法制备得到。
[0042]培养过程中隔2～4日换液一次，直至贴壁细胞彼此融合，铺满培养瓶底，再重复以上操作，传3代，每代培养7本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种骨髓基质干细胞的制备方法，包括以下步骤：获得原代骨髓基质干细胞；传代培养所述原代骨髓基质干细胞，获得第3代骨髓基质干细胞；二维培养所述第3代骨髓基质干细胞，得到第一细胞；以及三维培养所述第一细胞，得到第二细胞，所述第二细胞即为最终细胞。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述传代培养的步骤具体包括：将原代骨髓基质干细胞，用0.125％胰酶消化分离后，接种至无血清培养液使得BMSCs在培养体系中的初始浓度不低于105个/mL，于37℃、5％CO2条件间震荡培养，培养过程中隔2～4日换液一次，直至贴壁细胞彼此融合，铺满培养瓶底，再重复以上操作，传至第3代。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述二维培养的步骤具体包括：将二维薄膜贴敷于培养孔板中，再于每个孔板上倒入所述无血清液体培养液，同时接种所述第3代骨髓基质干细胞，并使得每孔中细胞浓度不低于105个/mL，培养7～9天。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫田秀明，
申请(专利权)人：广东格林邦卡新材料生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：