产生红系祖细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种体外产生红系祖细胞的方法，该方法包括使遗传修饰或未遗传修饰的造血干细胞与包含糖皮质激素和自噬诱导剂的限定细胞培养基接触。

Methods of producing erythroid progenitor cells

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生红系祖细胞的方法本专利技术属于医学领域。更具体来说，本专利技术涉及用于产生红系祖细胞和红细胞的新颖方法。
技术介绍
维持对组织的恒定氧气供应对于许多生物、尤其是人类的生存至关重要。红细胞通过血流在身体内运送氧气。这种转运是由血红蛋白提供的，血红蛋白是红细胞所特有的一种蛋白质，其能够结合氧。当红细胞到达组织时，氧通过毛细血管壁扩散。因此，红细胞的作用至关重要。在紧急情况(出血)和病理情况(血液疾病、癌症等)的情况下，需要输注红细胞。2016年，全球范围内采集了超过1亿个血袋并分发以满足输血需求。这些产品中有50％分布在富裕国家，仅占全球人口的15％。发展中国家的输血问题涉及输血供应和安全性，而在富裕国家，这些问题得到了更好的控制。然而，与慢性输血相关的免疫学并发症(同种免疫)可能导致涉及患者命运的输血僵局。迄今为止，输血仅基于来自供者的血液。在成人中，红细胞产生或红细胞生成发生在所谓的造血骨髓中，该骨髓存在于扁平骨中和长骨末端。在骨髓中，称为造血干细胞的多能干细胞依次分化为不同类型的红系祖细胞(BFU-E、CFU-E、原成红细胞、嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞)。当成红细胞离开骨髓时，它们失去了其细胞核，变成网织红细胞，然后变成成熟红细胞。允许体外产生红细胞的用于造血干细胞的分化培养基是已知的。然而，目前的方法对于大规模生产具有严重的缺陷，例如朝红细胞成熟的取向过快，这显著限制了生产产量，以及分化为无法正确执行去核步骤的细胞(AkimovS等人,2005,《干细胞》(Stemcells),23(9):1423-1433；HiroseSI等人,2013,《干细胞报告》(StemCellReports),1(6):499-508；HuangX,2013,《分子治疗》(Mol.Ther.),22(2):451-463)。最后，其它方法使用与饲养细胞共培养(KuritaR等人,2013,PloSOne,8(3):e59890)，这既实施复杂又昂贵。这样看来，体外产生红细胞的新颖方法的开发将有可能满足供应需求，以避免出现感染风险并避免免疫并发症。在此描述的本专利技术尤其旨在满足这些需求。
技术实现思路
专利技术人已经证实，在含有地塞米松、雷帕霉素小分子增强剂-28(SMER28)和任选地二甲基草酰甘氨酸(DMOG)的培养基中培养造血干细胞，不仅将这些干细胞分化为红系祖细胞，而且还显著扩增了该祖细胞群体并同时保留了它们最终分化为红细胞的能力。由此获得的红系祖细胞可以保持培养并扩增超过60天，而不会失去其分化为成熟去核细胞即红细胞的能力。根据第一方面，本专利技术涉及一种用于产生红系祖细胞的体外方法，所述方法包括使造血干细胞与细胞培养基接触，所述细胞培养基优选地适应于造血干细胞的营养需求并且特别地适应于造血系细胞的生长和/或分化，并包含糖皮质激素和自噬诱导剂。优选地，所述糖皮质激素选自可的松、氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安西龙、帕拉米松、倍他米松、地塞米松、可的伐唑及其衍生物和混合物。更特别优选地，所述糖皮质激素选自泼尼松、泼尼松龙和地塞米松。最特别优选地，所述糖皮质激素是地塞米松。优选地，所述自噬诱导剂选自雷帕霉素小分子增强剂-28(SMER-28)、SMER-10和SMER-18，及其组合。更特别优选地，所述自噬诱导剂是雷帕霉素小分子增强剂-28(SMER-28)。根据一个特定的实施方式，所述培养基还包含缺氧诱导因子(HIF)通路激活剂，优选脯氨酰羟化酶抑制剂，更优选二甲基草酰甘氨酸(DMOG)。造血干细胞优选通过多能干细胞、特别是胚胎干细胞(ES)或诱导性多能干细胞(iPS)的分化来获得，或者从脐带血或胎盘的有或没有转移(mobilization)的患者血液样品中或者骨髓样品或集合中分离。优选地，造血干细胞是人类造血干细胞。造血干细胞可以被遗传修饰成特别是过表达选自以下的一种或多种基因：人类端粒酶逆转录酶(HTERT)、B淋巴瘤Mo-MLV插入区1同源物(BMI1)、c-MYC、1-MYC和MYB。优选地，造血干细胞可以被遗传修饰成过表达HTERT基因或过表达BMI1基因。它们也可以被修饰成过表达HTERT基因和BMI1基因。选自人类端粒酶逆转录酶(HTERT)、B淋巴瘤Mo-MLV插入区1同源物(BMI1)、c-MYC、1-MYC和MYB的一种或多种基因优选置于一种或多种诱导型启动子的控制下。这些造血干细胞也可以被遗传修饰成过表达：-一种或多种核心红系网络(CEN)通路转录因子，优选LIM仅结构域2(LMO2)；和/或-一种或多种EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL通路基因，优选超大B细胞淋巴瘤(BCL-XL)。优选地，造血干细胞被遗传修饰成过表达BCL-XL基因或过表达LMO2基因。选自EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL通路基因的一种或多种基因优选在一种或多种组成型启动子的控制下。选自核心红系网络(CEN)通路转录因子基因的一种或多种基因优选在一种或多种诱导型启动子的控制下。造血干细胞也可以是永生化细胞。优选地，将细胞在本专利技术的培养基中培养至少20天，更优选至少40天，特别优选至少60天。在第二方面，本专利技术还涉及根据本专利技术的细胞培养基用于产生和/或扩增红系祖细胞的用途。在第三方面，本专利技术涉及如上所述的遗传修饰的造血干细胞，并且涉及这些造血干细胞用于体外产生红系祖细胞和/或红细胞的用途。在第四方面，本专利技术涉及一种用于产生红细胞的体外方法，该方法包括：-根据本专利技术的方法产生红系祖细胞；和-诱导所述红系祖细胞的成熟，-以及任选地，回收所获得的红细胞。优选地，通过在红细胞分化培养基中培养红系祖细胞来诱导红系祖细胞的成熟。在另一方面，本专利技术还涉及一种细胞培养基，其优选适应于造血系细胞的生长和/或分化，并且包含糖皮质激素，优选地塞米松，和自噬诱导剂，优选SMER-28，和任选地HIF通路激活剂，优选DMOG。优选地，所述培养基包含浓度为0.01mM至0.1mM的糖皮质激素，和/或浓度为2μM至30μM的自噬诱导剂，和/或浓度为75μM至350μM的HIF通路激活剂。所述自噬诱导剂优选选自雷帕霉素小分子增强剂-28(SMER-28)、SMER-10和SMER-18及其组合，并且更特别优选为SMER-28。所述糖皮质激素优选选自可的松、氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安西龙、帕拉米松、倍他米松、地塞米松、可的伐唑及其衍生物和混合物，更特别优选选自泼尼松、泼尼松龙和地塞米松，最特别优选为地塞米松。所述缺氧诱导因子(HIF)通路激活剂优选为脯氨酰羟化酶(PHIS)抑制剂，更优选为二甲基草酰甘氨酸(DMOG)。所述培养基还可包含(i)转铁蛋白，(ii)胰岛素，(iii)肝素和(iv)血清、血浆、血清合并物或血小板裂解物，优选血小板裂解物，以及任选地干细胞因子(SCF)、EPO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生红系祖细胞的体外方法，所述方法包括使造血干细胞与包含自噬诱导剂和糖皮质激素的细胞培养基接触。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170630 FR 17562221.一种产生红系祖细胞的体外方法，所述方法包括使造血干细胞与包含自噬诱导剂和糖皮质激素的细胞培养基接触。


2.权利要求1的方法，其中所述自噬诱导剂选自雷帕霉素小分子增强剂-28(SMER-28)、SMER-10和SMER-18，及其组合。


3.权利要求1或2的方法，其中所述自噬诱导剂是SMER-28。


4.权利要求1至3任一项的方法，其中所述糖皮质激素选自可的松、氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安西龙、帕拉米松、倍他米松、地塞米松、可的伐唑及其衍生物和混合物。


5.权利要求1至4任一项的方法，其中所述糖皮质激素选自泼尼松、泼尼松龙和地塞米松。


6.权利要求1至5任一项的方法，其中所述糖皮质激素是地塞米松。


7.权利要求1至6任一项的方法，其中所述培养基还包含缺氧诱导因子(HIF)通路激活剂，优选脯氨酰羟化酶(PHIS)抑制剂，更优选二甲基草酰甘氨酸(DMOG)。


8.权利要求1至7任一项的方法，其中所述造血干细胞是通过多能干细胞、特别是胚胎干细胞(ES)或诱导性多能干细胞(iPS)的分化而获得的，或是从患者血液样品、从脐带血或胎盘血或从骨髓样品中分离的。


9.权利要求1至8任一项的方法，其中所述造血干细胞是人类造血干细胞。


10.权利要求1至9任一项的方法，其中所述造血干细胞被遗传修饰成过表达选自人类端粒酶逆转录酶(HTERT)、B淋巴瘤Mo-MLV插入区1同源物(BMI1)、c-MYC、1-MYC和MYB的一种或多种基因。


11.权利要求1至10任一项的方法，其中所述造血干细胞被遗传修饰成过表达所述HTERT基因。


12.权利要求1至11任一项的方法，其中所述造血干细胞被遗传修饰成过表达所述BMI1基因。


13.权利要求1至10任一项的方法，其中所述造血干细胞被遗传修饰成过表达所述HTERT基因和所述BMI1基因。


14.权利要求1至13任一项的方法，其中选自人类端粒酶逆转录酶(HTERT)、B淋巴瘤Mo-MLV插入区1同源物(BMI1)、c-MYC、1-MYC和MYB的所述一种或多种基因被置于一种或多种诱导型启动子的控制下。


15.权利要求10至14任一项的方法，其中所述造血干细胞被进一步遗传修饰成过表达：
-一种或多种核心红系网络(CEN)通路转录因子，优选LIM仅结构域2(LMO2)；和/或
-一种或多种EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL通路基因，优选超大B细胞淋巴瘤(BCL-XL)。


16.权利要求10至14任一项的方法，其中所述造血干细胞被进一步遗传修饰成过表达所述BCL-XL基因。


17.权利要求10至14和16任一项的方法，其中所述造血干细胞被进一步遗传修饰成过表达所述LMO2基因。


18.权利要求15至17任一项的方法，其中选自EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL通路基因的所述一种或多种基因，优选BCL-XL，被置于一种或多种组成型启动子的控制下。


19.权利要求15至18任一项的方法，其中选自核心红系网络(CEN)通路转录因子基因的所述一种或多种基因，优选LIM仅结构域2(LMO2)，被置于一种或多种诱导型启动子的控...

【专利技术属性】
技术研发人员：劳伦斯·居约诺哈尔曼德，卢瓦克·加伦，弗雷德里克·奥雷德，尼古拉斯·瑞贝格，弗雷德里克·雷莱克斯，卢克·杜艾，
申请(专利权)人：法国血液机构，法国国家卫生及研究医学协会，索邦大学，巴黎第十二大学，
类型：发明
国别省市：法国;FR