在低温下保存细胞、组织或器官的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于在重度低温下保存优选人类细胞、组织或器官的方法，其包含如下步骤，在所述步骤期间将所述细胞、组织或器官保持在中度低温以及优选低氧和/或高二氧化碳氛围下，然后将所述细胞、组织或器官放置在重度低温下。

A method of preservation of cells, tissues, or organs at low temperatures

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在低温下保存细胞、组织或器官的方法本专利技术涉及一种用于中期和长期保存细胞、组织或器官的新方法。更具体地，该方法旨在用于保存移植物，直到它们移植在接受者中。
技术介绍
迄今为止，低温保存是用于中期和长期保存造血细胞移植物的唯一可用的方法。实际上，在未冷冻并且在4℃的温度下，观察到，在保存仅3天后，移植物中所含的祖细胞的数量和功能能力急剧降低(Hechler等人,1996)。然而，低温保存具有显著的缺点，特别是融化期间可能会凝集或因存在低温保护剂而引起过敏反应的风险。此外，该方法不适用于所有细胞类型。以前的研究显示，通过改变培养物的氛围条件，特别是通过降低氧气浓度和提高二氧化碳浓度能改善CD34+造血干细胞在4℃下的短期保存(Vlaski等人，2014)。虽然是显著的，但这些改善仍然不足以确保在4℃下长期保存时细胞并且特别是祖细胞的存活和功能能力的维持。最佳方法将允许在不冷冻的情况下在低温条件下长期保存移植物，并由此简化移植流程和程序，同时改善在接受者中获得的结果。
技术实现思路
专利技术人已显示，将细胞在中度低温以及低氧和/或高二氧化碳氛围下预温育，然后将细胞保存在重度低温下，使得可以大幅改善所述细胞的存活和增殖能力，特别是在干细胞的情况下。因此，根据第一方面，本专利技术涉及一种用于在重度低温下保存动物细胞、优选人类细胞的体外或离体方法，其包含如下步骤：将所述细胞维持在中度低温以及低氧和/或高二氧化碳氛围下约12至约72小时，然后将所述细胞保存在重度低温下。可以将细胞保存在温度为约1℃至约12℃、优选约4℃的重度低温下。可以将细胞维持在温度为约20℃至约35℃、优选约30℃的中度低温下。可以将细胞维持在中度低温以及低氧和/或高二氧化碳氛围下约24至约48小时，优选约48小时。低氧氛围可以包含约0.5％至约10％O2，优选约5％O2。高二氧化碳氛围可以包含约5％至约20％二氧化碳，优选约9％二氧化碳。优选地，将细胞维持在中度低温以及低氧和高二氧化碳氛围下。根据本专利技术方法保存的细胞可以是皮肤细胞、软骨细胞、骨细胞、内皮细胞、肌肉细胞、神经细胞、视网膜细胞、胰腺细胞、血细胞或能够分化成这些细胞的干细胞或祖细胞。这些细胞可以特别地被组织成组织，所述组织优选选自：皮肤、角膜、肌腱、骨组织、血管、神经、心脏瓣膜、羊膜、软骨组织、朗格罕氏岛(isletofLangerhans)和肌肉组织；或被组织成完整或部分器官，所述器官优选选自：肾脏、肝脏、心脏、脐带、胎盘、肠、肺和胰腺。优选地，保存的细胞是造血干细胞、间充质干细胞或其组合，优选造血干细胞。根据另一方面，本专利技术还涉及一种试剂盒，其包含细胞保存介质；用于接收细胞、组织或器官和细胞保存介质的第一无菌容器；用于在包含细胞、组织或器官的第一容器中产生低氧和/或高二氧化碳氛围的装置；以及任选地，用于将第一容器和/或细胞、组织或器官维持在受控温度下的第二容器。或者，试剂盒可以包含用于接收细胞、组织或器官和细胞保存介质的无菌容器，所述无菌容器含有低氧和/或高二氧化碳氛围，所述无菌容器任选地用细胞保存介质预填充。根据另一方面，本专利技术还涉及本专利技术的试剂盒用于实施本专利技术的方法(即用于在重度低温下保存动物细胞)的用途。附图说明图1：胎盘血CD34+细胞。相对于t＝0的活细胞得率。空气：21％O2和0.01％CO2；HH：9％CO2和5％O2；低氧：5％O2和0.001CO2；高二氧化碳：20％O2和20％CO2。*：p<0.5；**：p<0.01；***：p<0.001。图2：胎盘血CD34+细胞。相对于t＝0的克隆形成性祖细胞得率。空气：21％O2和0.01％CO2；HH：9％CO2和5％O2；低氧：5％O2和0.001CO2；高二氧化碳：20％O2和20％CO2。*：p<0.5；**：p<0.01；***：p<0.001。图3：人类间充质细胞。相对于t＝0的活细胞得率。空气：21％O2和0.01％CO2；HH：9％CO2和5％O2；低氧：5％O2和0.001CO2；高二氧化碳：20％O2和20％CO2。*：p<0.5；**：p<0.01；***：p<0.001。图4：人类间充质细胞。相对于t＝0的克隆形成性祖细胞得率。空气：21％O2和0.01％CO2；HH：9％CO2和5％O2；低氧：5％O2和0.001CO2；高二氧化碳：20％O2和20％CO2。*：p<0.5；**：p<0.01；***：p<0.001。图5：FDCPmix细胞。相对于t＝0的活细胞得率。空气：21％O2和0.01％CO2；HH：9％CO2和5％O2；低氧：5％O2和0.001CO2；高二氧化碳：20％O2和20％CO2。*：p<0.5；**：p<0.01；***：p<0.001。具体实施方式在先前的研究中，本专利技术的专利技术人观察到，相对于暴露于空气，低氧和高二氧化碳改善了造血干细胞的保存(Jeanne等人,2009；Ivanovic等人,2010；Vlaski等人,2014)。在本申请的实验部分中，专利技术人已经显示，相对于直接放置在4℃下，将干细胞在中度低温(30℃)下预温育2天，然后将所述干细胞转移至4℃非常显著地改善了这些细胞的存活和祖细胞的功能能力。当将预温育与低氧和/或高二氧化碳氛围组合时，获得的结果全部更加显著。在三种不同的细胞类型(即，CD34+造血细胞、间充质细胞和FDCPmix细胞系的细胞)上得到验证的这些结果表明，该方法可以用于改善低温下细胞、组织或器官的保存，特别是用于移植。因此，根据第一方面，本申请涉及一种用于在重度低温下保存动物细胞的体外或离体方法，其包含如下步骤：将所述细胞短时间维持在中度低温下，然后将所述细胞保存在重度低温下。本专利技术方法的目的在于当将动物细胞在不进行冷冻的情况下保存在重度低温下时改善其保存。如本文所用，术语“重度低温”指高于0℃并且低于15℃的温度。优选地，此术语指如下的温度：约1℃至约12℃，即约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12℃，优选约1℃至约8℃，并且特别是约2℃至约8℃。更特别优选地，重度低温对应于约1℃至约6℃、优选约4℃的温度。如本文所用，术语“约”是指指定值的±5％、优选指定值的±2％的值的范围。例如，“约20”包括20±5％，或19至21。应了解，前面有术语“约”的值也必须被认为其被具体描述在本申请中。例如，表述“约1℃至约12℃的温度”也必须被认为描述了“1℃至12℃的温度”。同样，表述“约4℃的温度”也必须被认为描述了“4℃的温度”。在放置在重度低温下之前，将细胞短时间维持在中度低温下。如本文所用，术语“中度低温”指约20℃至约35℃的温度，即约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35℃的温度，优选约25℃至约32℃的温度，更优选约27℃至约32℃的温度。更特别优选地，中度低温对应于约30℃的温度。在本专利技术的方法中，将细胞放置在中度低温下约12小时至约72小时，优选约24小时至本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在重度低温下保存动物细胞、优选人类细胞的体外或离体方法，其包含如下步骤：将所述细胞维持在中度低温以及低氧和/或高二氧化碳氛围下约12至约72小时，然后将所述细胞保存在重度低温下。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.23 FR 15536591.一种用于在重度低温下保存动物细胞、优选人类细胞的体外或离体方法，其包含如下步骤：将所述细胞维持在中度低温以及低氧和/或高二氧化碳氛围下约12至约72小时，然后将所述细胞保存在重度低温下。2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述细胞保存在温度为约1℃至约12℃、优选约4℃的重度低温下。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述细胞维持在温度为约20℃至约35℃的中度低温下。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述细胞维持在温度为约27℃至约32℃的中度低温下。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述细胞维持在温度为约30℃的中度低温下。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述细胞维持在中度低温以及低氧和/或高二氧化碳氛围下约24至约48小时，优选约48小时。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述细胞保存在重度低温下超过24小时。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述细胞保存在重度低温下1至15天。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述低氧氛围包含约0.5％至约10％O2，优选约5％O2。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述高二氧化碳氛围包含约0.5％至约20％二氧化碳，优选约9％二氧化碳。...

【专利技术属性】
技术研发人员：佐兰·伊万诺维奇，桑迪·热尔比，马丽亚·弗拉什基拉法热，
申请(专利权)人：法国血液机构，法国国家科学研究中心，波尔多大学，
类型：发明
国别省市：法国,FR