多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种从成体多器官中分离纯化NG2阳性干细胞群的有效方法，先从成体中枢神经系统、眼虹膜、骨髓、心脏、肝脏、胰腺、肺脏或肾脏组织中消化分离获得悬浮单个细胞群，再通过30%和70%percoll分离液离心分离获得NG2阳性干细胞群并进行原代培养，所得多器官源性成体NG2阳性干细胞群纯度高，增殖能力强，具有相似的发育学特性和干细胞潜能，对损伤信号反应及时、强烈，在相应器官损伤微环境下能够迅速分化为功能性修复细胞，有望作为新型干细胞群对损伤器官实施有效治疗；本发明专利技术不仅为今后深入研究多器官中NG2阳性细胞群的生物学特性及其在再生医学中的作用奠定了基础，而且为干细胞临床治疗和再生医学领域提供了新型干细胞群。

【技术实现步骤摘要】
多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法
本专利技术属于细胞分离纯化
，涉及一种成体干细胞群的分离纯化方法。
技术介绍
NG2（Nerve/Glial2）阳性细胞是一群主要分布在中枢神经系统（CentralNerveSystem,CNS）的细胞，被命名为少突胶质细胞祖先细胞（OligodendrocyteProcursorCells,OPCs）。传统概念定义，NG2阳性细胞是CNS所特有的具有修复功能的干细胞群。但目前NG2阳性细胞作为干细胞在发育期CNS中的研究较多，而由于缺少从成体CNS中分离纯化NG2阳性细胞的实用方法，关于NG2阳性细胞在成体CNS中是否同样具有干细胞潜能至今尚不清楚。此外，近年研究发现，CNS以外的其它器官也有NG2表达，例如血管窦周细胞（Pericytes,PCs），但目前研究证据还不足以支持PCs与NG2阳性细胞的同源性。最近Berry研究团队也报道，成年小鼠心脏主动脉有NG2表达，且表达NG2的细胞在特定诱导环境下可以分化为少突胶质细胞，提示NG2阳性细胞可能并非CNS所特有的干细胞群。当今从哺乳类个体成体的各组织器官中寻找具相似生物学特性和修复特性的单一群体细胞是干细胞研究的热点，而上述细胞群的分离纯化恰是其中的难点。该难点的攻破将为损伤器官的干细胞治疗开辟一条新的途径。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种从成体多器官中分离纯化具有相似生物学特性和干细胞潜能的NG2阳性细胞群的有效方法，为今后深入研究多器官中NG2阳性细胞群的生物学特性及其在再生医学中的作用奠定基础，并为干细胞临床治疗和再生医学领域提供新型干细胞群。经研究，本专利技术提供如下技术方案：1．多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法，包括以下步骤：a．分离成年哺乳类动物的中枢神经系统、眼虹膜、骨髓、心脏、肝脏、胰腺、肺脏或肾脏组织，去除被膜，用含有抗生素的MEM培养液充分冲洗并破碎组织；b．将步骤a破碎后的组织用细胞消化液消化，再用含有脱氧核糖核酸酶I、血清和抗生素的DMEM/F12培养液充分吹打分散细胞，用细胞筛过滤除去组织获得单细胞悬液，离心，弃上清；c．向步骤b离心后的细胞沉淀中加入30%Percoll分离液，混匀，再将混合物加至与30%Percoll分离液等体积的70%Percoll分离液的液面上，1500~3000rpm离心15~30分钟，收集位于两种Percoll分离液界面的细胞层，用含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液洗涤并重悬，制成细胞悬液；所述30%Percoll分离液是将percoll分离液与含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液按体积比为3:7混合制得；所述70%Percoll分离液是将percoll分离液与0.01mol/LPBS按体积比为7:3混合制得；d．将步骤c所得细胞悬液接种至预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，在温度为37℃、CO2气体体积分数为5%的条件下培养，每隔3~7天补加新鲜培养液1次，待NG2阳性干细胞初次出现时全量更换新鲜培养液，之后每隔3~4天全量更换新鲜培养液1次，当培养瓶铺满单层细胞时，即得原代NG2阳性干细胞群；所述新鲜培养液为新制的含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液，e．将步骤e所得原代NG2阳性干细胞群用细胞消化液消化后进行传代培养。优选的，步骤a中所述含有抗生素的MEM培养液是含有100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素的MEM培养液；步骤b和e中所述细胞消化液是胰酶/EDTA消化液，由质量分数为0.25%的胰酶溶液与质量分数为0.02%的EDTA溶液按体积比为1:1混合而成；步骤b中所述含有脱氧核糖核酸酶I、血清和抗生素的DMEM/F12培养液是含有质量分数为0.04%的脱氧核糖核酸酶I、质量分数为10%的胎牛血清、100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素的DMEM/F12培养液；步骤c和d中所述含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液是含有质量分数为10%的胎牛血清、100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素的DMEM/F12培养液。优选的，步骤b是向步骤a破碎后的组织中加入细胞消化液，在温度为37℃、CO2气体体积分数为5%的条件下孵育30分钟，再加入含有脱氧核糖核酸酶I、血清和抗生素的DMEM/F12培养液，充分吹打分散细胞，用孔径为70µm的细胞筛过滤除去组织获得单细胞悬液，2000rpm离心5分钟，弃上清。优选的，步骤c是向步骤b离心后的细胞沉淀中加入30%Percoll分离液，混匀，再将混合物加至与30%Percoll分离液等体积的70%Percoll分离液的液面上，2000rpm离心30分钟，收集位于两种Percoll分离液界面的细胞层，用含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液洗涤并重悬，制成细胞悬液。优选的，步骤d是将步骤c所得细胞悬液接种至预先用0.1mg/mL多聚赖氨酸溶液过夜包被的培养瓶中，在温度为37℃、CO2气体体积分数为5%的条件下培养，每隔7天补加新鲜培养液1次，待NG2阳性干细胞初次出现时全量更换新鲜培养液，之后每隔4天全量更换新鲜培养液1次，当培养瓶铺满单层细胞时，即得原代NG2阳性干细胞群。进一步，所述哺乳类动物为小鼠。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种从成体多器官中分离纯化NG2阳性干细胞群的通用方法，不仅从成体CNS中分离纯化出了具有干细胞潜能的NG2阳性细胞群，而且从其它成体多器官包括眼虹膜、骨髓、心脏、肝脏、胰腺、肺脏和肾脏中都分离纯化出了与成体CNS-NG2细胞具有相似发育学特性和干细胞潜能的NG2阳性细胞群。该方法通过Percoll不连续密度梯度离心分离纯化NG2阳性干细胞群，方法简单；采用常规细胞培养基进行细胞培养，不需要加入昂贵的细胞因子，经济实用；所得NG2阳性干细胞群纯度高，增殖能力强，具有显著的干细胞特性（自我更新和定向分化能力强），对损伤信号反应及时、强烈，在相应器官损伤微环境下能迅速分化为修复细胞，有望作为新型干细胞群对损伤器官如脑、脊髓、眼虹膜、骨髓、心脏、肝脏、胰腺、肺脏或肾脏等实施有效治疗。因此，本专利技术不仅为今后深入研究多器官中NG2阳性细胞群的生物学特性及其在再生医学中的作用奠定了基础，而且为干细胞临床治疗和再生医学领域提供了新型干细胞群。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步的描述。图1为从成年小鼠脊髓中分离纯化的NG2阳性干细胞群（简称为CNS-NG2），图中a为采用本专利技术方法从成年小鼠脊髓中分离纯化的NG2阳性细胞群；b为所得NG2阳性细胞群约95%以上表达NG2抗原（发红色荧光）；c为在溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine,LPC）作用下，成体CNS-NG2细胞（发红色荧光）表达神经干细胞标志物nestin（发绿色荧光）；d为在LPC作用下，成体CNS-NG2细胞（发红色荧光）表达窦周细胞标志物血小板源性生长因子受体β（PDGFR-β）（发绿色荧光）；e为在LPC作用下，成体CNS-NG2细胞（发红色荧光）不表达内皮细胞标志物血管性血友病因子（vonWillebrandFactor,vWF）（发绿色荧光）；f为在LPC作用下，成体CNS-NG本文档来自技高网...

【技术保护点】
多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：a．分离成年哺乳类动物的中枢神经系统、眼虹膜、骨髓、心脏、肝脏、胰腺、肺脏或肾脏组织，去除被膜，用含有抗生素的MEM培养液充分冲洗并破碎组织；b．将步骤a破碎后的组织用细胞消化液消化，再用含有脱氧核糖核酸酶I、血清和抗生素的DMEM/F12培养液充分吹打分散细胞，用细胞筛过滤除去组织获得单细胞悬液，离心，弃上清；c．向步骤b离心后的细胞沉淀中加入30%？Percoll分离液，混匀，再将混合物加至与30%？Percoll分离液等体积的70%？Percoll分离液的液面上，1500~3000rpm离心15~30分钟，收集位于两种Percoll分离液界面的细胞层，用含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液洗涤并重悬，制成细胞悬液；所述30%Percoll分离液是将percoll分离液与含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液按体积比为3:7混合制得；所述70%Percoll分离液是将percoll分离液与0.01mol/L？PBS按体积比为7:3混合制得；d．将步骤c所得细胞悬液接种至预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，在温度为37℃、CO2气体体积分数为5%的条件下培养，每隔3~7天补加新鲜培养液1次，待NG2阳性细胞初次出现时全量更换新鲜培养液，之后每隔3~4天全量更换新鲜培养液1次，当培养瓶铺满单层细胞时，即得原代NG2阳性干细胞群；所述新鲜培养液为新制的含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液，e．将步骤e所得原代NG2阳性干细胞群用细胞消化液消化后进行传代培养。...

【技术特征摘要】
1.多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：a．分离成年哺乳类动物的眼虹膜、骨髓、心脏、肝脏、胰腺、肺脏或肾脏组织，去除被膜，用含有抗生素的MEM培养液充分冲洗并破碎组织；所述哺乳类动物为小鼠；b．向步骤a破碎后的组织中加入细胞消化液，在温度为37℃、CO2气体体积分数为5%的条件下孵育30分钟，再加入含有脱氧核糖核酸酶I、血清和抗生素的DMEM/F12培养液，充分吹打分散细胞，用孔径为70µm的细胞筛过滤除去组织获得单细胞悬液，2000rpm离心5分钟，弃上清；c．向步骤b离心后的细胞沉淀中加入30%Percoll分离液，混匀，再将混合物加至与30%Percoll分离液等体积的70%Percoll分离液的液面上，2000rpm离心30分钟，收集位于两种Percoll分离液界面的细胞层，用含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液洗涤并重悬，制成细胞悬液；d．将步骤c所得细胞悬液接种至预先用0.1mg/mL多聚赖氨酸溶液过夜包被的培养瓶中，在温度为37℃、CO2气体体积分数为5%的条...

【专利技术属性】
技术研发人员：白莲花，帅领，赖洁娟，曾林立，张玉君，李瑶琛，张宏宇，别平，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：