用于获得人类褐色/米色脂肪细胞的方法技术

本发明专利技术涉及从白色脂肪组织细胞和/或间充质干细胞、尤其是从皮下白色脂肪组织细胞生产褐色/米色脂肪细胞的方法，以及所述褐色/米色脂肪细胞在受试者的基于细胞的疗法或在筛选平台中的用途。

Method for obtaining human Brown / Beige adipocytes

The present invention relates to the method of producing brown / brown adipocytes from white fat tissue cells and / or mesenchymal stem cells, especially from subcutaneous white fat tissue cells, and the use of the brown / brown adipocytes in the cell based therapy of the subjects or in the screening platform.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于获得人类褐色/米色脂肪细胞的方法
本专利技术涉及医学领域，特别是从白色脂肪组织或间充质干细胞获得褐色/米色脂肪细胞的方法。
技术介绍
肥胖以及与肥胖有关的代谢障碍例如糖尿病、心血管疾病和高血压是重要的全球健康问题。超过十亿成年人超重或肥胖，并且超过1.5亿成年人患有糖尿病，其中大部分是由肥胖相关的胰岛素抵抗导致的2型糖尿病(在CypessA.M.和KahnC.R.,2010,Curr.Opin.Endocrin.Diabetes&Obesity,17,pp.143-149中综述)。现在美国25％的儿童也超重或肥胖，导致在这一原先不受影响的群体中也出现了2型糖尿病。这些数字预期到2025年全球再增加超过一半。肥胖通常与脂肪细胞的异常积聚相关，在能量摄取超过能量消耗时出现。脂肪组织在肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病中发挥重要作用。在哺乳动物中存在两种主要类型的脂肪组织：白色脂肪组织(WAT)，其是甘油三酯储存和脂肪酸释放的主要位点，以及褐色脂肪组织(BAT)，其通过表达解偶联蛋白(UCP-1)而专门用于产热能量消耗。白色脂肪细胞亦称为白色脂肪组织(WAT)细胞，其以围绕脂质或脂肪滴的细胞质薄环为特征。WAT位于皮肤下面，提供了隔热、对冲击和震动的缓冲，以及能量储存。普通的瘦人具有约200亿至400亿个WAT细胞。肥胖的人可以具有比普通的瘦人多出高达十倍的WAT。BAT中用于产热的能量消耗用于在寒冷中维持体温或用于耗费食物能量。其在热量平衡和能量平衡中起作用，并且当有缺陷时，通常与肥胖相关。实际上，BAT通常在肥胖动物中萎缩。BAT在整体能量动态平衡中的重要性也被下面的发现所强调，即在小鼠中切除BAT导致严重的肥胖，并伴有胰岛素抵抗、高血糖症、高脂血症和高胆固醇血症(Lowell等,1993,Nature366(6457):740-2；Hamann等,l995,Diabetes,44(11):1266-73；Hamann等,1996,Endocrinology137(l):2l-9)。BAT在啮齿类和人类新生儿中较为丰富，但成年人类具有非常少的BAT，并且其量随年龄增加而降低。在过去几年中，WAT与BAT之间的比较导致了一个观念，即白色和褐色脂肪细胞具有不同的谱系(TimmonsJA等,2007,ProcNatlAcadSciUSA,13；104(11):4401-6)。褐色脂肪细胞起源于肌细胞谱系共同的祖细胞，并且以MYF5的表达为特征(SealeP等,2008,Nature,21；454(7207):961-7.)。最近，出现了第三种类型的完全分化的脂肪细胞：白褐色脂肪细胞，其被认定为亮色(brite)(PetrovicN等,2010,J.Biol.Chem.,285(10):7153–7164)或米色(IshibashiJ,SealeP,2010,Science,28；328(5982):1113-4.)。它具有褐色脂肪细胞共有的一部分特征例如表达解偶联蛋白1(UCP1)。在长期的PPARy激动剂处理(PetrovicN.等,2010)或β-3肾上腺素能受体刺激(SealeP等,2008)下，在小鼠中的一些“传统的”WAT库中出现了米色脂肪细胞。这些条件已经与对饮食诱导的肥胖和代谢改变的抵抗相关联。目前并没有与亮色/米色脂肪细胞在不同WAT位置中的存在与否及其作用相关的人类数据。白色和米色脂肪细胞是否具有共同的祖细胞(LeeYH等,2012,Adipocyte,1(4):230-236)和/或是否起源于白色脂肪细胞向褐色样脂肪细胞的分化转化(BarbatelliG等,2010,298(6):E1244-53)仍然需要进行明确。最近有人提出所有的成年人类BAT均是米色，而不是传统的BAT(Wu等,2012,Cell,150:1-11)。由于啮齿类和人类二者中褐色/米色细胞的量与肥胖负相关，这强烈提示增加个体中褐色/米色细胞数量的方法可能是限制肥胖和肥胖相关病理的一个策略。实际上，增加褐色/米色脂肪细胞的相对比例可能增加整体体能消耗并由此防止肥胖的发生。因此，治疗提议是将褐色/米色脂肪细胞引入到成年人类中以对抗肥胖。在该观点中，很少有报道描述了获得褐色样脂肪细胞的方法。然而，作者使用了特定的干细胞，尤其是来自多能干细胞如诱导的多能干细胞(iPS细胞)的干细胞或来自细胞系的干细胞(hMAD：人类专能脂肪来源的)。在遗传修饰后生成iPS细胞，其在成人中与形成褐色/米色脂肪组织相比，与胚胎发育更为相关。由于iPS细胞的致瘤性质，遗传修饰需要巨大的安全性。关于hMAD，它们源自于非常年轻的供体(没有hMAD是从成人脂肪组织中获得的)，并且通过生物工程程序进行选择，并且因此与成人脂肪组织以及调控其生物学的机制没有生理相关性。因此，对开发从人类成人样品和/或原代细胞中生产褐色/米色脂肪细胞的可靠方法仍然存在强烈需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出一种从人类白色脂肪组织或间充质干细胞生产成脂祖细胞并进一步将其分化成功能性褐色/米色脂肪细胞的新方法。因此，在第一方面，本专利技术涉及一种生产褐色/米色脂肪细胞的方法，优选体外方法，其包括-将选自白色脂肪组织细胞和间充质干细胞的细胞与分化培养基接触直至获得成脂祖细胞，所述分化培养基包含以下物质或基本上由以下物质组成：血清、糖皮质激素以及包含VEGF家族的生长因子、EGF家族的生长因子、胰岛素样生长因子和FGF家族的生长因子的生长因子混合物，-将所述成脂祖细胞与成脂剂接触直至获得褐色/米色脂肪细胞，以及-任选地回收所述褐色/米色脂肪细胞。优选地，与分化培养基接触的细胞为白色脂肪组织细胞，更优选为皮下白色脂肪组织细胞。分化培养基可以包括-约0.1ng/mL至约20ng/mL的EGF家族的生长因子，-约0.1ng/mL至约20ng/mL的FGF家族的生长因子，-约5ng/mL至约40ng/mL的胰岛素样生长因子，和/或-约0.05ng/mL至约10ng/mL、优选0.05ng/mL至约5ng/mL的VEGF家族的生长因子。特别地，EGF家族的生长因子可以选自表皮生长因子(EGF)、肝素结合性EGF样生长因子(HB-EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、双调蛋白(AREG)、上皮调节蛋白(EREG)、上皮细胞有丝分裂蛋白(EPGN)、乙胞素(BTC)以及神经调节蛋白-1、-2、-3和-4(NRG1、2、3和4)，优选为EGF；FGF家族的生长因子可以是FGF1或FGF2，优选为FGF2；胰岛素样生长因子可以选自IGF-1、IGF-2、IGFL1、IGFL2、IGFL3和IGFL4以及其合成类似物例如美卡舍明或long(R3)-IGF-1，优选为IGF-1或其类似物；和/或VEGF家族的生长因子可以选自VEGF-A，优选为VEGF-A拼接形式VEGF121、VEGF145或VEGF165、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PGF，更优选为VEGF，尤其是VEGF-A。优选地，生长因子混合物包括以下物质或由以下物质组成：(i)VEGF-A，优选VEGF165，(ii)EGF，(iii)IGF-1或其类似物，优选long(R3)-IGF-1，以及(iv)FGF2。优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生产褐色/米色脂肪细胞的体外方法，其包括‑将选自白色脂肪组织细胞和间充质干细胞的细胞与分化培养基接触直至获得成脂祖细胞，所述分化培养基包含以下物质或基本上由以下物质组成：血清、糖皮质激素以及包含VEGF家族的生长因子、EGF家族的生长因子、胰岛素样生长因子和FGF家族的生长因子的生长因子混合物，‑将所述成脂祖细胞与成脂剂接触直至获得褐色/米色脂肪细胞，和‑任选地回收所述褐色/米色脂肪细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.10 EP 15306153.61.生产褐色/米色脂肪细胞的体外方法，其包括-将选自白色脂肪组织细胞和间充质干细胞的细胞与分化培养基接触直至获得成脂祖细胞，所述分化培养基包含以下物质或基本上由以下物质组成：血清、糖皮质激素以及包含VEGF家族的生长因子、EGF家族的生长因子、胰岛素样生长因子和FGF家族的生长因子的生长因子混合物，-将所述成脂祖细胞与成脂剂接触直至获得褐色/米色脂肪细胞，和-任选地回收所述褐色/米色脂肪细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为白色脂肪组织细胞，优选皮下白色脂肪组织细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分化培养基包括-约0.1ng/mL至约20ng/mL的EGF家族的生长因子，-约0.1ng/mL至约20ng/mL的FGF家族的生长因子，-约5ng/mL至约40ng/mL的胰岛素样生长因子，和/或-约0.05ng/mL至约5ng/mL的VEGF家族的生长因子。4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中EGF家族的生长因子为EGF，FGF家族的生长因子为FGF2，胰岛素样生长因子为IGF-1或其类似物，和/或VEGF家族的生长因子为VEGF。5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述分化培养基包括约0.5％至约10％的血清、和/或约0.05μg/mL至约5μg/mL的糖皮质激素。6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述血清为胎牛血清，并且所述糖皮质激素为氢化可的松。7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中所述分化培养基还包括自由基清除剂或抗氧化剂，优选抗坏血酸。8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中所述成脂剂选自胰岛素或其类似物、非选择性磷酸二酯酶(PDE)抑制剂、β-肾上腺素能激动剂、噻唑烷二酮、糖皮质激素、骨形态生成蛋白(BMP)、它们的衍生物和混合物。9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述成脂剂为包括一种或多种选自胰岛素、地塞米松、吲哚美辛、IBMX、罗格列酮、BMP4和BMP7的成脂剂的混合物。10.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述成脂剂包括骨形态生成蛋白以及任选的胰岛素，所述骨形态生成蛋白优选选自BMP4和BMP7，更优选为BMP7。11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中所述成脂剂为骨形态生成蛋白，优选选自BMP4和BMP7，更优选为BMP7。12.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其中在能够形成3D球体的培养体系中将白色脂肪组织细胞或间充质干细胞与分化培养基接触，从而产生成脂祖细胞的球体。13.根据权利要求12所述的方法，其中将成脂祖细胞的球体转移到模拟细胞外基质并允许三维生长的3D培养基质中，然后与成脂混合物接触。14.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗雷德里克·德沙索，法比恩·吉约东，桑德拉·米勒，卢卡·森瑟比，路易斯·卡斯特拉，奥德丽·卡里埃帕萨特，
申请(专利权)人：法国血液机构，法国国家卫生及研究医学协会，保罗·萨巴提亚图卢兹大学III，法国国家科学研究中心，
类型：发明
国别省市：法国,FR