新型去除未分化干细胞和纯化精制心肌细胞的培养基制造技术

本发明专利技术的课题是找到能够更完全地对非心肌细胞或者未分化干细胞诱导细胞死亡、且能够仅挑选心肌细胞的新的条件。为了解决这样的课题，在本申请中提供用于诱导未分化干细胞的细胞死亡的细胞培养液，其为氨基酸组成中不含谷氨酰胺的物质，并且还提供通过在该细胞培养液中进行培养，从而对非心肌细胞诱导细胞死亡的方法。本申请中进而提供用于选择性地挑选心肌细胞的细胞培养液，其为添加乳酸、丙酮酸或脂肪酸、不含糖类且氨基酸组成中不含谷氨酰胺的物质，并且还提供通过在该细胞培养液中培养心肌细胞与非心肌细胞的混合物，从而选择性地挑选心肌细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型去除未分化干细胞和纯化精制心肌细胞的培养基
本专利技术涉及提供能够用于除去未分化干细胞和纯化精制心肌细胞的培养基。
技术介绍
由于成人人体中的心肌细胞失去了增殖活性，因而在严重的心肌梗塞、心肌病等疾病时不得不持续一直以来依赖于心脏移植的状况。然而，近年来，对于胚胎干细胞(ESCs)、诱导多能性干细胞(iPSCs)等具有多能性的干细胞的研究得以发展，由此而能够对这些具有多能性的干细胞进行分化/诱导来制作心肌细胞，将这样进行了诱导的心肌细胞用于移植医疗。然而，非生理的条件(即，invitro条件(体外条件))下的心肌细胞的分化方式与生理发育相同，首先形成未分化的中胚层细胞，其中一部分经过预定(presumptive)心肌细胞(前心脏中胚层)后分化为心肌细胞，但是具有多能性的干细胞基本上可以分化为构成脏器的所有细胞，因此在技术上难以仅通过分化/诱导的操作使其仅分化为心肌细胞这一种细胞。另外，在非生理的条件(invitro条件)下，有时难以引起对所有具有多能性的干细胞的目标分化，而在诱导后也残留一部分未分化干细胞。由此，在体外将干细胞诱导分化为心肌细胞时，具有多能性的所有干细胞会残留使心肌细胞以外的细胞作为副产物产生、使未分化干细胞残留这样的对包括移植在内的临床应用不利的性质。特别是，残留的未分化干细胞具有增殖活性且能分化为多种细胞，因此，如果在治疗时移植至生物体内的细胞中残留有未分化干细胞，则由该未分化干细胞形成畸胎瘤的危险性极高(非专利文献1(Miura,etal.,NatureBiotech.,743-745,2009))。出于这样的原因，难以将通过诱导多能性干细胞的分化而制作的含有心肌细胞的细胞团直接移植至生物体内并用于治疗。因此，为了安全地使用源自多能性干细胞的心肌细胞进行治疗并得到理想的治疗效果，有必要找到完全排除未分化的多能性干细胞且对心肌细胞进行高度精制的方法(即，除去除了心肌细胞以外的细胞的方法)。迄今为止，已经报告了在培养条件中选择性地除去未分化干细胞的方法(非专利文献2(Ben-David,etal.,CellStemCell,201312,pp.167-179)、非专利文献3(Wang,etal.,Science,325,435-439,2009))、非专利文献4(Shiraki,etal.,CellMetabolism,2014,19,1-15)。在非专利文献2中，发现油酸对于人的未分化多能性干细胞的维持是重要的，证实了：可以通过相反地利用该条件，抑制在人的未分化多能性干细胞内的油酸的生物合成，从而选择性地除去人的未分化多能性干细胞。另外，在非专利文献3中，证实了即使小鼠的胚胎干细胞(胚胎干细胞)能够在排除了除了苏氨酸以外的其它氨基酸的培养液中形成集落，但也无法在排除了苏氨酸的培养液中形成集落，并且证实了通过在除去了苏氨酸的培养液中进行培养，从而能够选择性地除去小鼠的未分化胚胎干细胞。在非专利文献4中，证实了：对于人多能性干细胞，蛋氨酸起到小鼠胚胎干细胞中的苏氨酸的作用，在除去了蛋氨酸的培养液中未分化干细胞死亡或者分化，因此能够选择性地除去人未分化干细胞。然而，在这些文献已证实的方法中，虽然能够除去未分化多能性干细胞，但是却不能除去已经诱导了的除了心肌细胞以外的分化的非心肌细胞。进而，在非专利文献3和非专利文献4中，由于在合成蛋白时除去了非常重要的必需氨基酸，因此也担心对残存的目标细胞的影响。因此，本专利技术的专利技术人的研究小组并非着眼于在合成蛋白时非常重要的必需氨基酸，而是着眼于能够由其它来源合成/供给的非必需氨基酸，其目的是不仅能够在由具有多能性的干细胞分化/诱导为心肌细胞时有效地除去未被分化/诱导而残留的未分化干细胞，而且也能够有效地除去分化/诱导心肌细胞时作为副产物产生的除了心肌细胞以外的细胞，并进行了如下研究。其中，发现多种心肌细胞所具有而其它细胞不具有的生理特征，利用这些特征，开发了从非心肌细胞、未分化干细胞中仅挑选心肌细胞的方法。专利文献1：基于细胞的相对的线粒体含量和/或细胞的相对的线粒体膜电位，从含有心肌细胞的细胞混合物中不改变心肌细胞的基因地选择心肌细胞的方法；从含有心肌细胞的细胞混合物中不改变心肌细胞的基因地浓缩心肌细胞的方法；不改变心肌细胞的基因地制造心肌细胞的方法；以及对含有心肌细胞的细胞混合物中的心肌细胞比率进行评价的方法(WO2006/022377)；专利文献2：通过在低血清条件、低糖条件、低营养条件、低钙条件、弱酸性pH条件、添加乳酸条件、添加天冬氨酸/谷氨酸条件和/或添加丙酮酸条件的培养液中对源自胚胎干细胞的心肌细胞进行培养，从而能够有效且高度地对心肌细胞进行选择/精制(WO2007/088874)；专利文献3：一种制作源自多能性干细胞的心肌细胞的细胞团的方法，其特征在于，通过使含有由多能性干细胞分化、诱导的心肌细胞的聚集的细胞团分散而成为单细胞，从而得到精制的源自多能性干细胞的心肌细胞，使用无血清条件下的培养基对该精制的源自多能性干细胞的心肌细胞进行培养，使该细胞聚集。(WO2009/017254)；专利文献4：通过对于多能性干细胞、非心肌细胞的培养条件添加没有确认到具有物理毒性、细胞死亡诱导作用的物质，从而非常有效地对除了心肌细胞以外的细胞诱导细胞死亡的方法(WO2010/114136)；而且专利文献5：一种测定培养心肌细胞的动作电位的方法，其特征在于，使培养液中的培养心肌细胞接触压敏性荧光色素，在培养液中添加维生素E和/或胆固醇，测定压敏性荧光色素的电压依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化。(WO2011/052801)。值得注意的是，专利文献2中发现：心肌细胞对于作为细胞培养的条件通常被认为是严酷的条件(如低糖条件、低血清条件、弱酸性pH条件、低钙条件、低营养条件、添加乳酸条件、添加天冬氨酸/谷氨酸条件、添加丙酮酸条件等条件)下的培养的耐性高，除了心肌细胞以外的细胞(即，非心肌细胞、未分化干细胞)会细胞死亡但心肌细胞存活，从而最终能够挑选出心肌细胞。而且，在使用小鼠的具有多能性的干细胞的研究中，特别是在这些条件中使用低糖条件和添加乳酸条件有助于最有效地挑选心肌细胞，因此也研究了是否可以在挑选源自人的具有多能性的干细胞的心肌细胞时也使用低糖条件和添加乳酸条件。然而，在有关源自人的具有多能性的干细胞的心肌细胞的研究中，低糖条件和添加乳酸条件的培养条件下虽然能够进行未分化干细胞的除去和心肌细胞的挑选，但除去未分化干细胞需要花费时间、以及在临床应用中因处理数亿个细胞而使未分化干细胞的混入概率增高，因此，寻求能够更完全更短时间地除去未分化干细胞的系统。通过基于葡萄糖的分解代谢反应并利用各种机理而生成ATP，细胞获得其存活所需的大部分能量。已知的是：基于葡萄糖的分解代谢反应而生成ATP的路径主要是：将进入细胞内的葡萄糖降解为丙酮酸的过程即糖酵解系统；使用通过丙酮酸的分解而生成的乙酰辅酶A并使循环运转的TCA循环(柠檬酸循环)；另外利用糖酵解系统和TCA循环中生成的NADH、NADPH、和FADH2而生成ATP的电子传递链。通常，细胞以从环境中摄取葡萄糖为前提来获得能量。在获得这样的能量时，基于糖酵解系统被活化且由糖酵解系统降解葡萄糖，从而本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞培养液，其特征在于，氨基酸组成中不含谷氨酰胺。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.16 JP 2014-1462831.一种细胞培养液，其特征在于，氨基酸组成中不含谷氨酰胺。2.根据权利要求1所述的细胞培养液，其用于使未分化干细胞产生细胞死亡。3.根据权利要求1或2所述的细胞培养液，其特征在于，氨基酸组成中进而不含丝氨酸和甘氨酸。4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞培养液，其特征在于，氨基酸组成中进而不含精氨酸。5.根据权利要求4所述的细胞培养液，其中，未分化干细胞为具有多能性的干细胞或具有多种分化潜能的干细胞。6.一种对未分化干细胞诱导细胞死亡的方法，其通过在氨基酸组成中不含谷氨酰胺的细胞培养液中进行细胞培养来进行。7.根据权利要求6所述的对未分化干细胞诱导细胞死亡的方法，其中，未分化干细胞为具有多能性的干细胞或具有多种分化潜能的干细胞。8.根据权利要求6或7所述的对未分化干细胞诱导细胞死亡的方法，其中，细胞培养液的氨基酸组成中进而不含丝氨酸和甘氨酸。9.根据权利要求6～8中任一项所述的对未分化干细胞诱导细胞死亡的方法，其中，细胞培养液的氨基酸组成中进而不含精氨酸。10.根据权利要求6～9中任一项所述的对未分化干细胞诱导细胞死亡的方法，其中，在不含所述特定的氨基酸的条件下，持续细胞培养12小时～360小时。11.一种细胞培养液，其特征在于，其中添加乳酸、不含糖类且氨基酸组成中不含谷氨酰胺。12.一种细胞培养液，其特征在于，其中添加丙酮酸、不含糖类且氨基酸组成中不含谷氨酰胺。13.一种细胞培养液，其特征在于，其中添加脂肪酸、不含糖类且氨基酸组成中不含谷氨酰胺。14.根据权利要求11～13中任一项所述的细胞培养液，其特征在于，氨基酸组成中进而不含丝氨酸和甘氨酸。15.根据权利要求11～14中任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：福田惠一，藤田淳，远山周吾，
申请(专利权)人：心脏康复株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP