一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用，该蛋白具有426个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白理论等电点为9.150，分子量为47.18kD；该蛋白具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所对应的基因序列中开放阅读框（ORF）全长1281bp。实验结果表明：河蟹肝胰腺组织切片的免疫组化结果进一步印证了这一推断。而且，基因序列分析显示Esflol蛋白含有两个可能的cAMP或cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点，提示Esflol存在参与到cAMP/cGMP介导的信号通路的可能性。结果证明Esflol是CHH调控的信号通路中的一环。对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白在和CHH特异结合，提升了熟蟹肝胰腺的营养价值和风味。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】一种对CHH具有结合活性的重组河蟹EsfIoI蛋白及应用 本研究受到国家自然科学基金青年基金（31302168);天津市应用基础与前沿技术 研究计划（一般项目）（14JCYBJC30700);天津师范大学博士基金（52XB1303)的支持。
本专利技术属于生物
，具体是一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esf1〇1蛋 白及应用。
技术介绍
甲壳动物高血糖激素（CHH)，是神经多肽激素家族的成员之一。该蛋白仅存在于节 肢动物中，在血淋巴葡萄糖水平调节、蜕皮以及应激过程中起着关键作用。虽然细胞膜上的 鸟苷酸环化酶（GC)已被公认为Y器官的CHH受体，但在肝胰脏中的受体仍然没有确定。在 本研究中，我们通过对河蟹转录组分析，筛选并克隆到了一个在去眼柄后表达量提高了 2. 8 倍的基因一中华绒螯蟹flotilin类似蛋白（Esflol)作为目标分子去研究。通过体外原核 表达系统，我们获得了重组flotilin蛋白。利用CHH与重组flotilin蛋白的Pull-down 实验以及大分子互作仪检测，我们发现CHH可以和floti1in直接结合。该结果是首次在甲 壳动物肝胰腺中发现的CHH结合蛋白，同时表明可以通过体外表达flotilin来调节CHH的 浓度。 甲壳动物高血糖素（CHH)属于CHH神经肽家族。这个家族包含了一类结构相关的 多肽，包括蜕皮抑制激素（MIH)，卵黄/精巢抑制激素（VIH/GIH)，大腭器抑制激素（M0IH)以 及离子转运多肽（ITP)。所有这些成员都只在节肢动物中发现。 学界广泛认为，CHH是能够调控几种生理活性的多效分子，如血糖水平，脂类代谢， 蜕皮与应激反应。第一次对CHH的描述是关于其对糖代谢的调控的。肝脏和肌肉是CHH的 主要靶标器官，肝脏在蜕皮过程中的所起到的作用是储存能量，肌肉亦是另一个糖原的储 存场所。学者们认为，CHH在对下游分子的调节机理上在肝脏和肌肉这两种器官中是明显 不同的。肌肉的糖原只供给其自身，相比之下肝脏所合成与储存的糖原是供给全身的。 在外界环境的胁迫下，机体中糖原的变化和总碳水化合物的变化总是伴随着CHH 的分泌量的变化。当剪去斑节对虾和罗氏沼虾的眼柄后，糖原磷酸化酶明显下降而糖原合 成酶的明显上升，这预示着去除眼柄能够促进糖原的积累。另外，肝胰腺在含CHH溶液中的 浸泡能够使得葡萄糖转化为糖原的比例降低。综合这些得到的证据表明CHH确实是参与肝 脏的糖原代谢的，但CHH的受体以及信号传导通路还是不明确。在甲壳动物中，已经明确的 证实了当减去眼柄之后，肝脏的细胞内cGMP水平会显著下降，而不是cAMP。也即表明，在甲 壳动物中蛋白激酶G替代了蛋白激酶A参与到了CHH介导酶激活系统。但是细胞膜表面直 接和CHH作用的分子依然悬而未决。flotilins被认为是定位在细胞膜表面脂後（lipidraft)上的连接性蛋白。除此 之外，它们能分布在细胞内体，吞体，高尔基体甚至细胞核，直到现在，关于flotilins是 否只在质膜上存在还没有定论。 在flotilin家族中存在两种同源异构体，flotilinl和flotilin2。一般认为， 这两类蛋白会相互结合形成异源多聚体，并参与到一些细胞活动中，如轴突再生，膜蛋白更 新，以及内吞作用等等。虽然flotilin在种间进化上十分保守，但它的确切功能依然存在 较大的争议并需要进一步的证据来证明许多的推断。最早，在金鱼的视网膜细胞轴突再生 的研究中发现了flotilin，当时被命名为再生reggies。敲除floti1ins可显著减弱机体对 胆固醇的吸收，这意味着它在NPC1L1介导的胆固醇吸收机制中起着关键的作用。在T细胞 中，flotilins被定位在细胞的一端，形成一个flotilin帽子结构，这个结构能够激活PrPe 导致主要的T细胞受体复合体CD3的回收，而连接这一受体和一类信号分子如Vav的通路 也被人们发现。也就是说，flotilin形成的亚结构能作为T细胞的信号平台。 据推测，在细胞某些特定位置的Flotilins能够参与细胞膜以及膜表面蛋白的更 新。在脂肪细胞，Flotilins能够从细胞深层将GLUT4回收到细胞表面。一些数据还支持 说Reggie/flotilin蛋白能在细胞相互接触的区域参与信号过程。 作为理解甲壳动物中Flotilin类似蛋白功能的第一步，我们找到了一个了河蟹 AshMirflotilin类似基因，命名为Esflol。在本研究中，我们对Esflol进行了原核表 达，并检测了其与CHH的结合能力。结果显示，Esflol能和CHH特异结合。
技术实现思路
本专利技术公开了一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白，其特征在于该 蛋白具有426个氨基酸，如SEQIDNO. 1所示，编码的蛋白理论等电点为9. 150,分子量为 47. 18kD;该蛋白具有SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列，所对应的基因序列中开放阅读框 (0RF)全长 1281bp。 本专利技术进一步公开了一种表达中华绒螯蟹Esflol的特异性引物，具有如下的核 苷酸序列： Fl:5 '-AATTCCATATGATTCCCATTTTCATCA-3' ； R1:5 '-AATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTACACGGAGGTT-3 '。 本专利技术更进一步公开了对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白在和CHH特 异结合，缩短中华绒螯蟹的生长期，加快其生长发育治疗方面的应用。其中缩短中华绒螯蟹 的生长期指的是提高河蟹肝胰腺糖原累积。实验结果证实： (1)本专利技术，证明CHH能够与Esflol产生特异性结合作用。 (2)本专利技术证实Esflol能够作为CHH的受体参与CHH对河蟹血糖水平的调控。 本专利技术公开的对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用所具有的积极 效果在于： (1)能够缩短养殖产业上中华绒螯蟹的养殖周期，实现养殖户利润的最大化。 (2)提高养殖河蟹的平均重量，增加亩产。 (3)提升熟蟹肝胰腺的营养价值和风味。 本专利技术所筛选的核苷酸及氨基酸序列如下： SEQIDNO. 1所示的Esflol核苷酸序列： ATGATTCCCATTTTCATCACGTGTCCGCCCAATGAAGTCCTGGTGGTGTCTGGCCTCGGGTTCACGCAGCC AGCCATGATCACTGGAGGCCGCGTGCTCGTCGTGCCCGGCCTGATGAGATGGAGCAGACTGTCCCTGAACGTTCGC 【附图说明】： 图1质粒PET30_Esflol转化至Rosetta菌株后PCRinsertcheck电泳结果； 图2Esflol中稀有密码子检测情况(灰色部分表示稀有密码子的种类及数量） 图3PET30-Esflol与空白PET30诱导表达以及破碎纯化SDS-PAGE检测结果； 图 4CHH抗体WesternBlot检测Pull-down各组分：1.T1 实验组，Bait:CHH,Prey:Esflol; 2.Cl对照组，Bait:Washsolution,Prey:Esflol;3.C2 对照组Bait:CHH, Prey:Washsolu本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白，其特征在于该蛋白具有426个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白理论等电点为9.150，分子量为47.18kD；该蛋白具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所对应的基因序列中开放阅读框（ORF）全长1281bp。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李冉，孙金生，耿旭云，张亦陈，田金泽，朱丽娜，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：天津;12