一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，其中：试剂R1包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、PEG、NaN3；试剂R2包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、NaN3、蔗糖、NGAL抗体致敏胶乳微粒；NGAL试剂参考标准品包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、EDTA、NaN3及不同含量的NGAL；NGAL抗体致敏胶乳微粒包括PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒，且PS纳米乳胶微粒的粒径大于PVN纳米胶乳微粒的粒径。本发明专利技术试剂组成构成简单、测试灵敏度好、线性范围广、稳定好，测试成本低廉，精度高，便于推广。

【技术实现步骤摘要】
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒
本专利技术涉及一种生物蛋白检测技术方案，特别是一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒。本申请中下列表达式的意义为：0.01-0.2MNaCl：表示溶液中NaCl浓度为0.01-0.2mol/L；0.1-3％蔗糖：表示每100mL溶液中加蔗糖0.1-3g。Tris：三羟甲基氨基甲烷；BSA：牛血清白蛋白；EDTA：乙二胺四乙酸；EDAC:水溶性碳二亚胺类交联剂；PEG：聚乙二醇；MES：一水吗啉乙磺酸；PVN指聚乙烯基萘，VN指其单体；SDS指十二烷基磺酸钠；KPS指过硫酸钾；本申请中跟上述表达式类似之处，所表达意义均跟上述意义类似；本申请中类似表达式另有说明的除外。
技术介绍
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(简称NGAL)是1993年在中性粒细胞内首先被发现的，与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程相关。近年来国内外的研究表明，NGAL蛋白在多种疾发过程中具有特异性表达变化的特点，使得NGAL成为检测疾病的生物标志物。在发生缺血性和毒性肾损伤过程中，肾小管上皮细胞中的NGAL将显著增加，在开始的两个小时内，尿液和血液中NGAL水平将显著增加，因此NGAL是早期急性肾损伤的敏感标志物。急性肾功能损伤预后将发展成为急性肾功能衰竭。通用的诊断方法如测定血清肌酐或者半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CystatinC)，只能在损伤后一天甚者几天内检测。有研究表明，健康志愿者尿液中NGAL含量检测结果分布0.7-9.6ng/ml，平均值为5.3ng/ml。而血浆中的含量检测结果为37-106ng/ml，平均值为63ng/ml。当肾损伤后，随机检测重病患者，尿液NGAL的浓度为110ng/ml到40000ng/ml不等。而他们EDTA抗凝血浆检测结果为25ng/ml到3491ng/ml。根据急性肾衰竭患者检测的90％阳性预测值判断，尿液中NGAL的阳性判断值为350ng/ml，而血浆检测的阳性判断值为400ng/ml。目前NGAL的测定方法主要有酶联免疫法、放射免疫法、Western-blotting以及化学发光法。酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大；放射免疫法存在着环境污染问题；Western-blotting操作复杂，测定精密度低；而化学发光法灵敏度虽高，但测定线性范围较小且检测成本较高，需要特定化学发光检测仪，这些原因导致其应用范围较小。胶乳增强免疫透射比浊法也是测定人血浆或尿液中NGAL浓度的常用方法，该方法对仪器设备要求不高，没有环保和操作人员自身防护等问题。与其他测定方法比较，该方法简便快速、灵敏可靠，普通自动或半自动生化分析仪就可，有较大应用范围，较大的实用价值。NGAL浓度在正常人尿液中低于10ng/ml，在重度肾病患者尿液中浓度可高达7000ng/ml以上。如此宽广的浓度范围，对检测试剂盒灵敏度和线性范围均提出了较高的要求。目前市场上已有胶乳增强免疫透射比浊法测定人血浆或尿液中NGAL浓度的试剂盒，但这些试剂盒无法同时满足宽线性范围和高灵敏度的要求，因此需要稀释样本才能测定高浓度NGAL，这在使用上带来了不便。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术公开了一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，组成构成简单、测试灵敏度好、线性范围广、稳定好，测试成本低廉，精度高，便于推广，在很大程度上能提高扩大检测的线性范围，提高检测灵敏度。本专利技术公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2以及NGAL试剂参考标准品，其中：试剂R1包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、PEG、NaN3；试剂R2包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、NaN3、蔗糖、NGAL抗体致敏胶乳微粒；NGAL试剂参考标准品包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、EDTA、NaN3及不同含量NGAL，所述NGAL抗体致敏胶乳微粒包括PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒(胶乳微粒中PVN纳米胶乳微粒的含量占胶乳微粒总体积的50-80％)，且PS纳米乳胶微粒的粒径大于PVN纳米胶乳微粒的粒径。本方案中通过大粒径的PS微球和小粒径的PVN微球相配合，从而有利于在整体上改善试剂的检测灵敏度和扩大线性范围，较大粒径PS微球可以提高灵敏度，但偶联抗体量较小，线性范围也相应较窄。乙烯基萘(VN)因萘环与碳碳双键共轭，其在一定波长范围内的吸光值比苯乙烯强，从而可以通过较小粒径的PVN微粒来改善检测灵敏度和增强扩大检测的线性范围，同时经检测在同一波长下，粒径较小的PVN微球与粒径较大的PS微球具有相近的A值(紫外吸光光度法)，并且采用混合型的微球体系有利于控制整体的成本和加工性能。本专利技术公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进，PS纳米胶乳微粒的粒径为120nm-180nm.本专利技术公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进，PVN纳米胶乳微粒的粒径为80nm-120nm。本专利技术公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进，PVN纳米胶乳微粒的制备为：在PH8-10的碳酸盐缓冲液中，加入SDS、KPS以及VN单体，KPS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.1-0.3wt％，在常压保护气氛围和水浴条件下搅拌反应后，提取胶乳微粒并清洗后即可。本专利技术公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进，SDS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.08-0.15wt％。本方案中SDS浓度的大小对所制备出的PVN纳米微球的粒径具有显著影响。当SDS浓度较大时，所生成的PVN胶束数目越多，而其形成的PVN胶束粒径却随之减小，在一定范围可用调节SDS浓度的方法来调节PVN乳胶粒的粒度,从而控制PVN纳米胶乳微粒的粒径为80nm-120nm。本专利技术公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进，水浴的温度为70-85摄氏度。本专利技术公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进，保护气氛围为氮气和二氧化碳混合气，其中二氧化碳占混合气总量的5-15(v/v)％。通过采用氮气和二氧化碳混合气作为保护气，不仅仅可以起到保护隔绝降低杂质和副反应发生的作用，还可以通过调节二氧化碳的含量来调节和维持碳酸缓冲液的PH，提高缓冲液的缓冲能力，从而维持PVN胶乳微粒的制备稳定性，提高微粒的质量。本专利技术公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2以及NGAL试剂参考标准品，其中：试剂R1：Tris10-100mMNaCl50-200mMBSA0.05％-1％Tween-200.01％-0.1％PEG0.5％-3％NaN30.1％试剂R2：Tris10-100mMNaCl50-200mMBSA0.05％-1％Tween-200.01％-0.1％NaN30.1％蔗糖1％-10％NGAL抗体致敏胶乳微粒0.1％-1％，NGAL抗体致敏胶乳微粒直径50-150nm；NGAL试剂参考标准品：Tris10-100mMNaCl50-200mMBSA0.05％-1％Tween-200.01％-0.1％EDTA0.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2以及NGAL试剂参考标准品，其中：试剂R1包括Tris、NaCl、BSA、Tween‑20、PEG、NaN3；试剂R2包括Tris、NaCl、BSA、Tween‑20、NaN3、蔗糖、NGAL抗体致敏胶乳微粒；NGAL试剂参考标准品包括Tris、NaCl、BSA、Tween‑20、EDTA、NaN3及不同含量的NGAL，其特征在于：所述NGAL抗体致敏胶乳微粒包括PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒，且PS纳米胶乳微粒的粒径大于PVN纳米胶乳微粒的粒径。

【技术特征摘要】
1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2以及NGAL试剂参考标准品，其中：试剂R1包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、PEG、NaN3；试剂R2包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、NaN3、蔗糖、NGAL抗体致敏胶乳微粒；NGAL试剂参考标准品包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、EDTA、NaN3及不同含量的NGAL，其特征在于：所述NGAL抗体致敏胶乳微粒包括PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒，且PS纳米胶乳微粒的粒径大于PVN纳米胶乳微粒的粒径，所述胶乳微粒中PVN纳米胶乳微粒的含量占胶乳微粒总体积的50-80％；所述PS纳米胶乳微粒的粒径为120nm-180nm；所述PVN纳米胶乳微粒的粒径为80nm-120nm。2.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈媛，许琴，张闻，周海滨，王建飞，
申请(专利权)人：宁波瑞源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33