一种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法，还公开了该DWD抗菌肽在制备抗菌蛋白与蛋白酶抑制剂蛋白方面的应用。利用本发明专利技术制备的重组中国对虾具有双乳清酸性蛋白结构域（DWD）抗菌肽能够直接抑制常见细菌的生长，而且可以抑制细菌生长过程中分泌的蛋白酶的活性，可以在食品抗菌生物试剂、医用抗生素替代品方面具有较大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法，还公开了该DWD抗菌肽在制备抗菌蛋白与蛋白酶抑制剂蛋白方面的应用。利用本专利技术制备的重组中国对虾具有双乳清酸性蛋白结构域（DWD）抗菌肽能够直接抑制常见细菌的生长，而且可以抑制细菌生长过程中分泌的蛋白酶的活性，可以在食品抗菌生物试剂、医用抗生素替代品方面具有较大的应用前景。【专利说明】—种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法
本专利技术涉及一种中国对虾具有双乳清酸性蛋白结构域(DWD)的抗菌肽分子的制备方法，以及这种DWD抗菌肽分子的抑菌活性与蛋白酶抑制剂活性的应用，属于基因工程
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技术介绍
长期以来，在我国食品和药品行业存在着一个难以解决的问题，那就是食品行业和医药行业广泛使用的保鲜剂、抗菌剂、抗生素带来的严重后果。食品行业目前广泛使用的保鲜剂、抗菌剂多数属于化学药品和试剂，这些化学药品和试剂与食品的包装存在于一个空间，一旦被人体吸收将造成十分不良的后果；医药行业被广泛使用的抗生素，目前已经暴露出了滥用抗生素从而不断刺激病菌浸染和致病能力增强的后果，因此，在食品和药品行业寻找绿色、安全、对人体健康没有影响的生物类抗菌物质，已经是一个科学研究的热点问题了。在动物的进化史上，低等的动物不像我们人类具有特别发达的后天获得性免疫系统，它们仅仅具有一个固有的、特定的先天免疫系统，正是因为这个较为低等的先天免疫系统的防御功能，才使得数量众多的、进化地位低等的无脊椎动物进化到今天仍然存在于地球上，这也说明了这个低等的先天免疫系统防御功能的强大之处。通过不断研究，存在于低等无脊椎动物体内先天免疫系统的神秘面纱逐渐被揭开，原来在先天免疫系统中主要存在着细胞免疫和体液免疫两种方式，当病毒、细菌、真菌入侵这类动物机体的时候，这两种免疫途径几乎是同时发挥功能的。其中，值得一提的是先天免疫系统体液免疫途径中的抗菌肽分子是清除入侵细菌和真菌的主要免疫效应分子，而且，抗菌肽分子几乎是体液免疫途径中多种信号传导途径的最后表达出来的那个执行清除功能的效应分子，针对革兰氏阳性细菌、针对革兰氏阴性细菌以及针对真菌入侵的各种信号传导途径，通过免疫刺激信号的逐级传递和放大，最终激活了相关抗菌肽基因的转录与翻译，从而形式抗菌功能。因此，抗菌肽分子表达量的高低，直接关系到病原是否能够被彻底清除。在众多抗菌肽分子中，有一类分子比较特别，这类抗菌肽分子的典型特点就是存在着由8个半胱氨酸残基形成的4对二硫键而折叠形成的一个球状实体结构域,这个结构域被称为乳清酸性蛋白结构域，简称WAP结构域，在不同的分子中WAP结构域的数量有所不同，常见的是存在一个和两个WAP结构的抗菌肽分子。这类具有乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽分子在发挥清除细菌作用的过程，主要是通过分子的活性位点针对细菌细胞壁的特殊结构进行破坏，从而引起细菌细胞壁产生“漏洞”将细胞内溶物释放出来，引起细菌自身的死亡，所以，这类抗菌肽的抗菌活性具有广泛的作用范围。所以，这类抗菌肽具有如下的优点:第一，作用范围广。第二，作用条件温和。第三，不会引起细菌的抗药性问题。第四，对人体无危害，因为它属于蛋白质物质，进入人的肠道之后便可被蛋白酶彻底水解形成氨基酸营养物质。中国对虾是我国稀有的水产产品，集中分布在我国东部沿海，也是我国主要的水产经济动物。中国对虾在进化过程中，面临白斑综合症病毒以及各种细菌的侵染能够保持以较大的数量分布在我国东部沿海水域，说明其抗病毒、抗细菌、抗真菌能力特别强大。因此，如果将中国对虾具有双乳清酸性蛋白结构域(DWD)的抗菌肽在体外进行重组表达，获得具有抗菌活性和蛋白酶抑制剂活性的重组分子，它在食品抗菌、医用抗生素替代方面具有较大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种中国对虾具有双乳清酸性蛋白结构域(DWD)抗菌肽的制备方法，同时提供该DWD抗菌肽抑菌活性和蛋白酶抑制剂活性的研究方法。技术解决方案:本专利技术的具体方法如下:I)中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段的克隆:取冷冻保存的中国对虾3只-5只，无菌条件下解剖收集肝脏组织供100mg-150mg，利用动物基因组DNA小量提取试剂盒(TaKaRa公司产品)进行中国对虾肝脏基因组DNA的提取，具体方法参照试剂盒说明书。之后，以lyL-2yL中国对虾肝脏基因组DNA作为模板，以前引物DWD-F:5'-tac tea gaa ttcacg aga ggcccg cta aag c_3 和后弓丨物 DWD-R:5 -tac tea ctc gag tct gcg ctt agaegg act g-3'作为扩增中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段的一对引物，PCR反应的程序为:94°C预变性3min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min-10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳处理，并且在凝胶成像仪紫外灯下将目的片段所在凝胶条带切下回收，利用DNA胶回收试剂盒(TaKaRa公司产品)进行目的片段的纯化与回收，获得中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段溶解液； 2)中国对虾DWD抗菌肽基因的原核表达载体的构建:取步骤(I)的中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段溶解液16 μ L，进行内切酶EcoR I和Xho I的双酶切处理，20 μ L的体系中基因表达片段为16 μ L，内切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer缓冲液为2 μ L，同时，取大肠杆菌pET_28a质粒载体溶解液10 μ L进行内切酶EcoR I和Xho I双酶切处理，20 μ L的体系中质粒载体溶解液为10 μ L，内切酶EcoR I和Xho I各I μ L，IOXH Buffer缓冲液为2 μ L，无菌水6 μ L，之后，取双酶切处理的DWD抗菌肽基因表达片段6 μ L，双酶切处理后的大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液2 μ L，再加T4DNA连接酶I μ L和IOX ligationbuffer缓冲液I μ L，在16°C金属浴中进行10h_12h连接，获得连接产物；3)转化大肠杆菌克隆菌株DH5CI感受态细胞与阳性克隆子的筛选:将步骤(2)的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5a感受态细胞(TaKaRa公司产品)，主要是利用“热激法”进行转化，要求卡那霉素的最终质量体积浓度为25 μ g/ μ L，将固体LB培养基平板在37°C条件下过夜培养10h-12h，之后，挑取固体LB培养基平板表面的单个白色菌落，以前引物 DWD-F:5'-tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3' 和后引物 DWD-R:5'-tactea ctc RaR tct gcg ctt aga egg actg-3'作为菌落PCR反应的一对引物,进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，进行LB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：1）中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段的克隆：取中国对虾3只?5只，无菌条件下解剖收集肝脏组织供100mg?150mg，利用动物基因组DNA小量提取试剂盒进行中国对虾肝脏基因组DNA的提取，之后，以1μL?2μL中国对虾肝脏基因组DNA作为模板，进行PCR反应来扩增中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳处理，并且在凝胶成像仪紫外灯下将目的片段所在凝胶条带切下回收，利用DNA胶回收试剂盒进行目的片段的纯化与回收，获得中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段溶解液；2）中国对虾DWD抗菌肽基因原核表达载体的构建：取步骤（1）的中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段溶解液16μL，进行内切酶EcoRΙ和XhoΙ的双酶切处理，20μL的体系中基因表达片段为16μL，内切酶EcoRΙ和XhoΙ各1μL，10×H?Buffer缓冲液为2μL，同时，取大肠杆菌pET?28a质粒载体溶解液10μL进行内切酶EcoRΙ和XhoΙ双酶切处理，20μL的体系中质粒载体溶解液为10μL，内切酶EcoRΙ和XhoΙ各1μL，10×H?Buffer缓冲液为2μL，无菌水6μL，之后，取双酶切处理的DWD抗菌肽基因表达片段6μL，双酶切处理后的大肠杆菌pET?28a质粒载体溶解液2μL，再加T4DNA连接酶1μL和10×ligation?buffer缓冲液1μL，在16℃金属浴中进行连接10h?12h，获得连接产物；3）转化大肠杆菌克隆菌株DH5α感受态细胞与阳性克隆子的筛选：将步骤（2）中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5α感受态细胞（TaKaRa公司产品），主要是利用“热激法”进行转化，卡那霉素的最终质量体积浓度为25μg/μL，固体LB培养基平板在37℃条件下培养10h?12h，之后，挑去固体LB培养基平板表面的单个白色菌落，以前引物DWD?F：5`?tac?tca?gaattc?acg?aga?ggc?ccg?cta?aag?c?3`和后引物DWD?R：5`?tac?tca?ctc?gag?tct?gcg?ctt?aga?cgg?act?g?3`作为菌落PCR反应的一对引物，进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为：94℃预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸5min?10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，进行LB液体培养基震荡培养10h?12h，获得阳性克隆菌株菌液；4）质粒提取：取步骤（3）中的阳性菌株菌液1mL，利用质粒DNA小量提取试剂盒进行质粒提取，获得阳性重组质粒；5）转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）感受态细胞与阳性表达菌株的筛选：将步骤（4）的阳性重组质粒，利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）感受态细胞，卡那霉素的最终质量体积浓度为25μg/μL，固体LB培养基要求在37℃条件下过夜培养10h?12h，之后，挑去固体LB培养基平板表面的单个白色菌落，以前引物DWD?F：5`?tac?tca?gaa?ttc?acg?aga ggc?ccg?cta?aag?c?3`和后引物DWD?R：5`?tac?tca?ctc?gag?tct?gcg?ctt?aga?cgg?act?g?3`作为菌落PCR反应的一对引物，进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为：94℃预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸5min?10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，利用3mL?5mL液体LB培养基进行液体震荡培养，液体摇瓶培养的条件为：37℃，180rpm?200rpm，培养12h?14h，获得阳性表达菌株菌液；6）中国对虾DWD抗菌肽的诱导表达与亲和纯化：将步骤（5）的阳性表达菌株菌液作为诱导表达的母液，从其中取1mL菌液在无菌条件下转接到一瓶100mL新鲜的液体LB培养基中，要求卡那霉素的最终质量体积浓度为50μg/mL，在37℃、180rpm?200rpm条件下转培养3h?4h之后，在无菌条件下加入IPTG进行诱导表达，IPTG最终物质的量浓度为0.1mmol/L?0.5mmol/L，诱导表达的条件为在37℃、18...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜志强，王金星，赵小凡，张雪峰，王建英，
申请(专利权)人：内蒙古科技大学，
类型：发明
国别省市：