本发明专利技术公开了一种极耐热木聚糖酶基因及其表达蛋白与应用，该极耐热木聚糖酶基因的DNA序列如SEQ?NO：1所示。极耐热木聚糖酶基因表达的极耐热木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ?NO：2所示。该极耐热木聚糖酶具有极强的耐热性能和中性pH条件下高活性的特性，在95℃、pH7.0的条件下酶活性最高，比酶活达到145.8U/mg；该蛋白酶在温度为70-100℃、pH为5.5-8.5的范围内，均具有较高的酶活。该木聚糖酶的耐热性能极高，在85℃、添加终浓度为5mMCa2+的反应体系中，保温2h酶活性保持不变。上述特性使得本发明专利技术得到的木聚糖酶比现有木聚糖酶具有更大的优越性，适用于80℃以上高温、中性pH条件下半纤维素的降解，具有潜在的工业应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程技术及生物质利用领域，具体涉及一种极耐热木聚糖酶基因及其表达蛋白与应用。
技术介绍
木聚糖是植物细胞壁半纤维素的主要成分，是除纤维素之外自然界中最为丰富的可再生资源。木聚糖酶是木聚糖降解酶系中的最为关键的多糖水解酶，通过随机切割木聚糖的β-1，4-糖苷键，将木聚糖水解为木寡糖、低聚木糖及少量的木糖和阿拉伯糖。由于木聚糖酶在造纸工业中纸浆的预漂白、作为添加剂动物提高饲料及烘焙食品的质量及以木聚糖为原料生产功能性低聚木糖等方面都体现出优良特性，因此可作为一种高效的工业酶制 剂。
技术实现思路
专利技术目的针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种极耐热木聚糖酶基因，以使其满足使用要求。本专利技术的另一目的是提供一种上述极耐热木聚糖酶基因的表达蛋白。本专利技术还有一目的是提供上述一种极耐热木聚糖酶基因的应用。技术方案为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下 一种极耐热木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ NO 1所示。上述的极耐热木聚糖酶基因表达的极耐热木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ NO 2所示。一种极耐热木聚糖酶，氨基酸序列为权利要求2所述的SEQ NO :2序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白质。一种重组体系，在所述的重组体系上克隆有如SEQ NO 1所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。一种用于扩增极耐热木聚糖酶基因的引物，所使用的引物对为Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGAGAC-3’ ；Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTAGTCAGGATCAGGTTG-3’ 。上述的极耐热木聚糖酶在酶解木聚糖中的应用。酶解反应温度为70-100°C，PH5. 5-8. 5。所述的木聚糖来源于纤维原料中的半纤维素，包括榉木木聚糖、桦木木聚糖和燕麦木聚糖。上述的重组体系在酶解木聚糖中的应用。上述的极耐热木聚糖酶在酶解玉米秸杆中的应用。有益效果与现有技术相比，本专利技术所提供的木聚糖酶具有极强的耐热性能和中性pH条件下高活性的特性，在95°C、pH7. O的条件下酶活性最高，比酶活达到145. 8U/mg ；该蛋白酶在温度为70°C -100°C、pH为5. 5-8. 5的范围内，均具有较高的酶活。该木聚糖酶的耐热性能极高，在85°C、添加终浓度为5mM Ca2+的反应体系中，保温2h酶活性保持不变。上述特性使得本专利技术得到的木聚糖酶比现有木聚糖酶具有更大的优越性，适用于80°C以上高温、中性PH条件下半纤维素的降解，具有潜在的工业应用价值。附图说明图I是木聚糖酶Tth xynlOA的SDS-PAGE蛋白电泳 图2是Tth xynlOA的最适温度结果 图3是Tth xynlOA的最适pH结果 图4是Tth xynlOA的热稳定性结果 图5是Tth xynlOA降解玉米秸杆半纤维素TLC图。 具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。以下实施例中所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例I木聚糖酶基因Tth xynlOA的制备 可采用如下人工合成的方式制备似基因，也可以以thermarum的总DNA为模版通过PCR的方式得到。本研究的木聚糖酶基因RA 似通过上海捷瑞生物工程有限公司合成，基因序列如SEQ NO 1所示 实施例2木聚糖酶基因Tth xynlOA的亚克隆 用下述引物对PCR扩增实施例I中的木聚糖酶基因Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGAGAC-3’ ；Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTAGTCAGGATCAGGTTG-3’ ； 上述引物合成时，Tth-I引入Nde I酶切位点，Tth-2引入Xho I酶切位点。PCR 反应体系I μ L T. thermarum 基因组 DNA, 1μ L Tth-1, IuL Tth-2, 25 μ LPremix ExTaq, 22 μ L 超纯水。PCR 反应条件94°C变性 5min ;94°C变性 30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸 3min，30Cycles ;72°C延伸 IOmin ;4°C保温。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化(BIOMIGA，上海)。实施例3重组克隆、表达载体pET-20b-7iA xynlOA的构建与验证 将纯化过的PCR产物(实施例2制备)、pET-20b (Novagen)用分别Nde I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切酶切PCR及载体大片段。割胶回收后的目的片段与载体，经浓缩加入8yL无菌水重悬，加入IyL IOXLigase Buffei^PlyL Ligase，于16°C连接过夜。用连接反应产物转化大肠杆菌pET-20b，然后涂于含IOOy g/mL Amp (氨苄青霉素)的培养皿，37°C培养 10-12h。从转化平板上挑取多个单菌落，采用BIOMIGA的质粒小量提取试剂盒提取质粒。对获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示，pET-20b载体中插入了所克隆的目的片段(核苷酸长度为3474bp)，进而得到重组克隆、表达载体pET-20b-RAxynlOAAth xynlOA的DNA序列如SEQ NO :1所示,其表达的蛋白(极耐热木聚糖酶)的氨基酸序列如SEQ NO 2所示，将该蛋白命名为Tth XynlOA0实施例4重组木聚糖酶Tth xynlOA的表达与纯化 将重组克隆、表达载体pET-20b-RA xynlOA (实施例3制备)电转至宿主菌疋coliBL21(DE3) (Novagen)，获得含有重组质粒的重组菌。将单菌落的重组菌接种于5mL含有100 μ g/ml氨节青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培养基,在37°C温度下,200rpm震荡培养8-12h。将上述4mL菌液接种于含400mL培养基的IOOOmL摇瓶中，37°C温度下，200rpm震荡培养，当吸光度达到O. 6-0. 8时，加人200 μ L的IM IPTG，并在30°C温度下，120rpm诱导表达10-12h。用高速冷冻离心机将培养液在4°C下一下以13000rpm离心15min，收集菌体。用50mL超纯水洗漆并在4°C下一下以13000rpm离心15min,回收菌体,接着用20mLIXBinding Buffer 重悬(0.5M NaCl, 20mM Tris_HCl，5mM imidazole，ρΗ7· 9)，在冰水浴中，用超声波破碎机破碎细菌细胞，并在4°C下13000rpm离心15min，得到含木聚糖酶TthxynlOA的粗提液。粗提液先经70°C加热处理30min的热处理，除去不耐热的杂蛋白，再用Ni-NTA亲 和层析柱进行纯化(方法见His-Bind Kits,Novagen)。纯化酶纯度的鉴定和分子量的测定采用SDS-PAGE方法进行，结果见图1，SI表示pET_20b空质粒表达出的蛋白，S2表示经粗提液中的Tth xynlOA蛋白，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种极耐热木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ？NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王飞，时号，李迅，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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