本发明专利技术公开了一种耐高温重组β-甘露聚糖酶及其应用。将来自黑曲霉的按照毕赤酵母密码子偏好性优化后的β-甘露聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中，转化至毕赤酵母KM71H中，可得到高表达量的重组β-甘露聚糖酶。该重组β-甘露聚糖酶最适温度为80℃。将本发明专利技术的β-甘露聚糖酶用于酶解魔芋精粉生产甘露低聚糖，底物浓度高，产物产量高，反应时间短，转化率高，具有较大的工业化生产潜力和应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种耐高温重组β-甘露聚糖酶及其应用
本专利技术涉及一种耐高温重组β -甘露聚糖酶及其应用，属于生物工程
。
技术介绍
甘露低聚糖是由甘露糖与葡萄糖以β_1，4糖苷键连接形成的聚合度为2~10的功能性寡糖。甘露低聚糖具有促进人和动物肠道内以双歧杆菌为代表的有益菌的增殖、改善肠道内菌群结构等功能性低聚糖共同的理化特性，同时也有清除自由基、增强机体抗氧化性的能力，若将甘露低聚糖作为功能性食品添加剂应用于工业开发，应用前景十分广阔。魔芋是我国云南、四川、陕西、贵州等地盛产的多年生草本植物，其芋块茎中含有丰富的甘露聚糖。目前，魔芋粉主要被作为食用粗纤维或作为食品添加剂，开发利用程度不够。利用β_甘露聚糖酶将魔芋水解制成甘露低聚糖，可大大拓宽魔芋粉的应用范围，提高原料附加值，具有广泛的经济效益和社会效益。酶法制备甘露低聚糖的核心技术是采用高活力甘露聚糖酶和高浓度魔芋胶溶液。但目前发酵酶活力低，导致酶的生产和使用成本高；同时由于魔芋胶水溶液的粘度非常大，40g/L的魔芋胶已呈凝胶状态，可阻止酶对它的水解作用。因此国内外文献报道的魔芋胶酶水解工艺均采用10~30g/L的魔芋胶溶液，导致了酶解产物的后处理成本高、生产效率低。因此解决酶法制备甘露低聚糖所遇到的问题，首先要得到活力高稳定性好的β -甘露聚糖酶，其次是优化酶解工艺提高底物浓度。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种耐高温重组甘露聚糖酶。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述β -甘露聚糖酶酶解高浓度魔芋粉制备甘露低聚糖的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下:一种耐高温重组β -甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ IDNo:2所示。一种耐高温重组甘露聚糖酶的编码基因，是满足下列要求的核苷酸序列之(I)编码如SEQ ID No:2所示氨基酸序列的核苷酸序列；(2)如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。一种表达耐高温重组甘露聚糖酶的重组菌株，该菌株为基因组上整合了权利要求2所述的β-甘露聚糖酶的编码基因的毕赤酵母。其中，所述的毕赤酵母为分泌型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。构建上述重组菌株的方法，它包括如下步骤:(I)应用常规重组质粒构建方法构建出重组密码子优化质粒pPICZ a A - man,该质粒以AOXl为启动子，并含有SEQ ID No:1所示的β -甘露聚糖酶基因和Zeocin抗性基因；(2)将重组密码子优化质粒pPICZ a A - man用Sac I酶切线性化后，电击转化入毕赤酵母宿主菌中，即构成表达β -甘露聚糖酶的毕赤酵母重组菌株；(3)将重组菌株经过甲醇利用表型筛选、外源基因多拷贝整合筛选以及诱导表达筛选后，即筛选出过量表达甘露聚糖酶的重组工程菌。步骤(1)中，所述的重组质粒pPICZa A-man是密码子偏好性优化后合成的目的基因man插入到质粒pPICZ a A中形成的重组质粒。具体方法参见Invitrogen公司的Mult1-Copy Pichia Expression Kit 操作手册。步骤(2)中，在将重组密码子优化质粒pPICZ a A - man用Sac I酶切线性化之后，电击转化入毕赤酵母宿主菌中之前，可将密码子优化质粒pPICZ a A - man导入大肠杆菌进行扩增。上述耐高温重组β -甘露聚糖酶的制备方法,将上述重组菌在BMGY培养基中30°C培养至细胞密度OD6tltlnm = 2~6，室温离心收集菌体，用BMMY液体培养基将细胞重悬至OD600nm为1.0以诱导表达，28 °C继续培养72h，每24h向培养基添加纯甲醇至终浓度为Iv/v%，将完成培养的重组菌经离心除去菌体，收集上清液，以分子量为IOKDa的超滤管，滤去小分量的蛋白和盐，经过分子筛Superdex75PrepGrade纯化,使用100mmol/L pH5.0的朽1檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，流速0.3ml/min洗脱，分布收集洗脱峰中的样品，经过酶活测定，确定目的样品所在的收集管，得到电泳纯的目的蛋白，该重组β_甘露聚糖酶酶活为1168IU/mg,最适反应温度为80°C,最适pH为5.0。上述耐高温 重组甘露聚糖酶在酶法制备甘露低聚糖中的应用。优选的是，以富含甘露聚糖的生物质为原料酶法制备甘露低聚糖，所述的生物质为魔芋粉、田菁胶、刺槐豆胶和瓜尔胶的一种或多种更有选的是，以10_50IU/g的耐高温重组β -甘露聚糖酶添加量、于ρΗ4.0-6.0、50-90°C的震荡或搅拌条件下酶解底物浓度为30-200g/L生物质溶液，酶解0.5_8h后降温离心去残渣,上清即为甘露低聚糖。最优选的是，底物浓度为100_200g/L的高浓度生物质，酶用量为10_50IU/g，酶初始阶段一次性加入，底物分多次添加(也就是说先按照100-200g/L的浓度计算生物质的总添加量，然后分多次添加)，添加时间间隔在l_3h，pH4.0-6.0、50-90°C的震荡或搅拌条件下共酶解4-12h后冷却后离心去残渣，上清即为甘露低聚糖。有益效果:本专利技术与现有技术相比，具有如下优势:(I)本专利技术中的重组β_甘露聚糖酶产量高，活力强，稳定性好。(2)本专利技术中的重组β -甘露聚糖酶可高效酶解魔芋粉，β -甘露聚糖酶和魔芋粉的最适比例为50IU/g，低于以往报道。酶解50g/L魔芋粉时甘露低聚糖得率为78%，甘露低聚糖浓度为39g/L，单糖含量很低。(3)本专利技术中优化后的酶解工艺和魔芋粉补料添加工艺可大大提高重组β -甘露聚糖酶对高浓度底物的酶解效率，最高甘露低聚糖浓度为81g/L，高于以往报道。【附图说明】图1是β -甘露聚糖酶的SDS-PAGE图谱。图2是魔芋粉酶法水解过程pH优化。图3是魔芋粉酶法水解过程酶解温度优化。图4是魔芋粉酶法水解过程底物浓度优化。图5是魔芋粉酶法水解过程酶用量优化。图6是魔芋粉酶法水解过程酶解时间优化。图7是β -甘露聚糖酶降解魔芋精粉离子色谱检测结果。【具体实施方式】以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围。实施例1:重组质粒的构建。重组质粒pPICZ a A - man是按照毕赤酵母密码子偏好性优化后的β -甘露聚糖酶基因(如SEQ IDNo:1所示)插入到质粒pPICZ a A中形成的。实施例2:目的DNA的准备及毕赤酵母的电转化。将所得到的大肠杆菌转化子培养，提取质粒，采用Sac I进行酶切，通过纯化试剂盒纯化得到线性的目 的DNA ;分别制取毕赤酵母GSl 15、ΚΜ71Η、SMDl 168、X - 33的电转感受态细胞；将80 μ I电转感受态细胞与10 μ I的线性化DNA混合，转入2mm电转化杯中电击，电击参数为:1500V, 25 μ F，200 Ω。实施例3:转化子的筛选。将电转化后的毕赤酵母GS115、ΚΜ71Η、SMDl 168, X - 33感受态细胞涂布于含有100 μ g/mL博来霉素的YPDS平板上，30°C条件下培养直至转化子出现，该转化子即为毕赤酵母重组菌株。挑取四种不同的单克隆，接种至25ml BMGY培养基中30°C培养至细胞密度OD6tltol=2~6，室温离心收集菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐高温重组β‑甘露聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
【技术特征摘要】
1.一种耐高温重组β -甘露聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。2.一种耐高温重组β_甘露聚糖酶的编码基因，其特征在于，是满足下列要求的核苷酸序列之一: (1)编码如SEQID No:2所示氨基酸序列的核苷酸序列； (2)如SEQID No: I所示的核苷酸序列。3.一种表达耐高温重组甘露聚糖酶的重组菌株，其特征在于，该菌株为基因组上整合了权利要求2所述的β-甘露聚糖酶的编码基因的毕赤酵母。4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述的毕赤酵母为分泌型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。5.构建权利要求3所述的重组菌株的方法，其特征在于，它包括如下步骤: (1)应用常规重组质粒构建方法构建出重组密码子优化质粒pPICZa A - man,该质粒以AOXl为启动子，并含有SEQ ID No:1所示的β -甘露聚糖酶基因和Zeocin抗性基因； (2)将重组密码子优化质粒pPICZa A - man用Sac I酶切线性化后，电击转化入毕赤酵母宿主菌中，即构成表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母重组菌株； (3)将重组菌株经过甲醇利用表型筛选、外源基因多拷贝整合筛选以及诱导表达筛选后，即筛选出过量表达甘露聚糖酶的重组工程菌。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的重组质粒pPICZ a A - man是密码子偏好性优化后合成的目的基因man插入到质粒pPICZ a A中形成的重组质粒。7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，在将重组密码子优...
【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳嘉，倪玉佳，周旻昱，郑兆娟，李鑫，朱均均，徐勇，勇强，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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