用于改善的蛋白质产生的组合物和方法技术

本公开的方面涉及改善来自宿主细胞的分泌性铜酶的表达的方法，其通过操纵涉及铜在宿主细胞中的转运的一种或多种蛋白质的表达水平实现，所述蛋白质例如膜结合的铜转运ATP酶和可溶性铜转运蛋白。本公开还提供了包含此类经过改善的宿主细胞的组合物以及来源于包含一种或多种感兴趣的铜酶的经过改善的宿主细胞的产物。

Compositions and methods for improved protein production

Aspects of the present disclosure relates to a method of improving the expression from the host cell secretory copper enzyme, its expression level through the manipulation of one or more proteins involved in copper transport of the host cell, the protein such as membrane bound copper transporter ATP enzymes and soluble copper transport protein. The present disclosure also provides compositions comprising such improved host cells and products derived from improved host cells comprising one or more of the copper enzymes of interest.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改善的蛋白质产生的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2014年8月15日提交的美国临时专利申请序列号62/038,095的优先权，其全文以引用方式并入本文。序列表根据37C.F.R.§1.52(e)通过EFS提交的序列表以引用方式并入本文。通过EFS提交的序列表文本文件包含于2015年7月10日创建的、大小为44千字节的文件“40456-WO-PCT_ST25.txt”。
本公开的方面涉及改善来自宿主细胞的分泌性铜酶(cuproenzyme)的表达的方法，其通过操纵一种或多种铜金属伴侣蛋白，例如膜结合的铜转运ATP酶和可溶性铜转运蛋白的表达水平实现。本公开还提供包含此类经过改善的宿主细胞的组合物以及由包含一种或多种感兴趣的铜酶的经过改善的宿主细胞制备的产物。介绍铜是具有氧化还原活性的过渡金属，其为多种酶(在本文称为铜酶)的必需辅因子。然而，由于其毒性，细胞中游离铜的含量必须保持在低水平。因此，少于总细胞铜的0.01％在细胞质中是游离的；大多数铜被金属硫蛋白所结合和螯合以防止其细胞毒性作用。此外，细胞中的不同区室具有不同的铜含量，其中线粒体具有比细胞质更高的铜含量，细胞质继而比高尔基体具有更高的含量。在用于在已工程化以过表达一种或多种功能性铜酶的重组宿主细胞中产生此类酶的工业环境中，细胞中的游离铜的有限可用性是有问题的。由于以上指出的细胞铜梯度，在生产分泌性铜酶时，这一问题尤其明显。然而，在宿主细胞培养期间以实现正确平衡提供额外的铜是一个相当大的技术挑战，所述平衡即：促进功能性和分泌性铜酶的产生，而不会变得对宿主细胞有毒性。除了与由宿主细胞产生铜酶相关的问题之外，对于从工厂排放的废水中允许的铜含量也有规定。因此，可向铜酶发酵过程添加的铜的量也存在上限。因此，需要研发重组宿主细胞和使用此类宿主细胞来改善铜酶在发酵过程中的产生的方法。
技术实现思路
本专利技术的方面至少部分地基于以下发现：一种或多种铜金属伴侣蛋白在期望的重组宿主细胞，例如丝状真菌宿主细胞中的增加的表达可改善分泌性铜酶在宿主细胞中的产生。因此，本文提供了在基本上相同的培养条件下，与不具有一种或多种铜金属伴侣蛋白的增加表达的亲本宿主细胞相比，表现出改善的铜酶产生/分泌的具有一种或多种铜金属伴侣蛋白的增加表达的重组宿主细胞。还提供了由这些宿主细胞产生铜酶的方法以及包含由此类宿主细胞产生的铜酶的组合物。可用于主题组合物和方法的分泌性铜酶的示例包括但不限于：裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、漆酶、酪氨酸酶、胺氧化酶、胆红素氧化酶、儿茶酚氧化酶、多巴胺β-单加氧酶、半乳糖氧化酶、己糖氧化酶、L-抗坏血酸氧化酶、肽基甘氨酸单加氧酶、多酚氧化酶、槲皮素2,3-双氧化酶、以及过氧化物歧化酶。本专利技术的方面包括但不限于以下：1.一种用于由宿主细胞产生铜酶的方法，包括：在表达铜酶的宿主细胞中过表达铜金属伴侣蛋白，以及在足以产生铜酶的条件下培养宿主细胞，其中当在基本上相同的培养条件下培养时，与不过表达铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞相比，所述宿主细胞产生增大量的铜酶。2.根据1所述的方法，其中铜酶是从宿主细胞中分泌的。3.根据1或2所述的方法，其中铜酶选自由以下项构成的组：裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、漆酶、酪氨酸酶、胺氧化酶、胆红素氧化酶、儿茶酚氧化酶、多巴胺β-单加氧酶、半乳糖氧化酶、己糖氧化酶、L-抗坏血酸氧化酶、肽基甘氨酸单加氧酶、多酚氧化酶、槲皮素2,3-双氧化酶、以及过氧化物歧化酶。4.根据以上任一项所述的方法，其中铜酶与宿主细胞是内源的。5.根据以上任一项所述的方法，其中铜酶与宿主细胞是异源的。6.根据以上任一项所述的方法，其中通过源自宿主细胞的启动子控制铜酶和/或铜金属伴侣蛋白的表达。7.根据6所述的方法，其中宿主细胞为里氏木霉(Trichodermareesei，T.reesei)细胞，并且启动子为源自里氏木霉的丙酮酸激酶(pki)或纤维二糖水解酶I(cbh1)启动子。8.根据以上任一项所述的方法，其中宿主细胞表达至少一种另外的铜酶，其中在基本上相同的培养条件下，与不过表达铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞相比，至少一种另外的铜酶的产生增加。9.根据以上任一项所述的方法，其中铜金属伴侣蛋白为膜结合的铜转运ATP酶。10.根据9所述的方法，其中膜结合的铜转运ATP酶包含与SEQIDNO:6具有至少60％同一性的氨基酸序列。11.根据9或10所述的方法，其中膜结合的铜转运ATP酶选自表2。12.根据1-8中任一项所述的方法，其中铜金属伴侣蛋白为可溶性铜转运蛋白。13.根据12所述的方法，其中可溶性铜转运蛋白包含与SEQIDNO:3具有至少60％同一性的氨基酸序列。14.根据12或13所述的方法，其中可溶性铜转运蛋白选自表1。15.根据以上任一项所述的方法，还包括在宿主细胞中过表达第二铜金属伴侣蛋白。16.根据15所述的方法，其中第一铜金属伴侣蛋白为包含与SEQIDNO:6具有至少60％同一性的氨基酸序列的膜结合的铜转运ATP酶并且第二铜金属伴侣蛋白为包含与SEQIDNO:3具有至少60％同一性的氨基酸序列的可溶性铜转运蛋白。17.根据以上任一项所述的方法，其中宿主细胞为丝状真菌宿主细胞。18.根据17所述的方法，其中丝状真菌宿主选自由以下项构成的组：曲霉属(Aspergillus)、枝顶孢属(Acremonium)、出芽短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、头孢霉属(Cephalosporium)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛壳菌属(Chaetomium)、拟青霉属(paecilomyces)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、内座壳属(Endothia)、Endothiamucor、镰孢属(Fusarium)、粘帚霉属(Gilocladium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、毛霉菌属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、平革菌属(Phanerochaete)、柄孢壳菌属(Podospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、梨孢霉属(Pyricularia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophylum)、壳多胞菌属(Stagonospora)、踝节菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)、嗜热菌属(Thermomyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、毛癣菌属(Trichophyton)、栓菌属(Trametes)、以及侧耳菌属(Pleurotus)。19.根据17所述的方法，其中丝状真菌宿主细胞为里氏木霉、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、或埃默森篮状菌(Talaromycesem本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于由宿主细胞产生铜酶(cuproenzyme)的方法，包括：在表达铜酶的宿主细胞中过表达铜金属伴侣蛋白，以及在足以产生所述铜酶的条件下培养所述宿主细胞，其中当在基本上相同的培养条件下培养时，与不过表达所述铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞相比，所述宿主细胞产生增加的量的所述铜酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.15 US 62/038,0951.一种用于由宿主细胞产生铜酶(cuproenzyme)的方法，包括：在表达铜酶的宿主细胞中过表达铜金属伴侣蛋白，以及在足以产生所述铜酶的条件下培养所述宿主细胞，其中当在基本上相同的培养条件下培养时，与不过表达所述铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞相比，所述宿主细胞产生增加的量的所述铜酶。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述铜酶是从所述宿主细胞中分泌的。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述铜酶选自由以下项构成的组：裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、漆酶、酪氨酸酶、胺氧化酶、胆红素氧化酶、儿茶酚氧化酶、多巴胺β-单加氧酶、半乳糖氧化酶、己糖氧化酶、L-抗坏血酸氧化酶、肽基甘氨酸单加氧酶、多酚氧化酶、槲皮素2,3-双氧化酶、以及过氧化物歧化酶。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述铜酶与所述宿主细胞是内源的。5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述铜酶与所述宿主细胞是异源的。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中通过源自所述宿主细胞的启动子控制所述铜酶和/或所述铜金属伴侣蛋白的表达。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述宿主细胞为里氏木霉(Trichodermareesei，T.reesei)细胞，并且所述启动子为源自里氏木霉的丙酮酸激酶(pki)或纤维二糖水解酶I(cbh1)启动子。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞表达至少一种另外的铜酶，其中在基本上相同的培养条件下，与不过表达所述铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞相比，所述至少一种另外的铜酶的产生水平增加。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述铜金属伴侣蛋白为膜结合的铜转运ATP酶。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述膜结合的铜转运ATP酶包含与SEQIDNO:6具有至少60％同一性的氨基酸序列。11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述膜结合的铜转运ATP酶选自表2中列出的那些。12.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述铜金属伴侣蛋白为可溶性铜转运蛋白。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述可溶性铜转运蛋白包含与SEQIDNO:3具有至少60％同一性的氨基酸序列。14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述可溶性铜转运蛋白选自表1中列出的那些。15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，还包括在所述宿主细胞中过表达第二铜金属伴侣蛋白。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一铜金属伴侣蛋白为包含与SEQIDNO:6具有至少60％同一性的氨基酸序列的膜结合的铜转运ATP酶，并且所述第二铜金属伴侣蛋白为包含与SEQIDNO:3具有至少60％同一性的氨基酸序列的可溶性铜转运蛋白。17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为丝状真菌宿主细胞。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述丝状真菌宿主选自由以下项构成的组：曲霉属(Aspergillus)、枝顶孢属(Acremonium)、出芽短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、头孢霉属(Cephalosporium)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛壳菌属(Chaetomium)、拟青霉属(paecilomyces)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、内座壳属(Endothia)、Endothiamucor、镰孢属(Fusarium)、粘帚霉属(Gilocladium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、毛霉菌属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、平革菌属(Phanerochaete)、柄孢壳菌属(Podospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、梨孢霉属(Pyricularia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophylum)、壳多胞菌属(Stagonospora)、踝节菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)、嗜热菌属(Thermomyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、毛癣菌属(Trichophyton)、栓菌属(T...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·M·马德里，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：美国,US