木葡聚糖内糖基转移酶变体以及编码其的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及木葡聚糖内糖基转移酶变体。本发明专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Glucan endo transferase variants and polynucleotides encoding them

The present invention relates to variants of the endo glucan transferase. The present invention also relates to polynucleotides encoding these variants, nucleic acid constructs comprising these polynucleotides, vectors and host cells, and methods of using these variants.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】木葡聚糖内糖基转移酶变体以及编码其的多核苷酸参照序列表本申请包含计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。专利技术背景专利
本专利技术涉及木葡聚糖内糖基转移酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。相关领域描述木葡聚糖内糖基转移酶(XET)是一种催化木葡聚糖(植物细胞壁的结构多糖)的内切-转糖基作用的酶。该酶存在于大多数植物中，并且具体地是陆生植物。已经从双子叶植物和单子叶植物中提取出XET。还没有在工业微生物中实现商业相关水平的木葡聚糖内糖基转移酶的异源表达。在本领域中，对改进木葡聚糖内糖基转移酶在工业重要微生物中的表达存在需要。本专利技术提供了与其亲本相比具有增加的表达产量的木葡聚糖内糖基转移酶变体。专利技术概述本专利技术涉及分离的木葡聚糖内糖基转移酶变体，这些变体包括与SEQIDNO:2的全长多肽的位置10、30、40、51、53、60、99、102、117、130、136、157、162、175、183、254、以及280相对应的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代，其中这些变体具有木葡聚糖内糖基转移酶活性。本专利技术还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生这些变体的方法。本专利技术还涉及用于获得这些变体的方法和增加木葡聚糖内糖基转移酶的表达产量的方法。本专利技术进一步涉及包括这些变体的组合物。附图简要说明图1示出了pMMar27的限制性图谱。图2示出了pEvFz1的限制性图谱。图3示出了pDLHD0006的限制性图谱。图4示出了pDLHD0044的限制性图谱。图5示出了pDau571的限制性图谱。图6示出了pDLHD0075的限制性图谱。图7示出了pDLHD0095的限制性图谱。定义等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。编码序列：术语“编码序列”意指直接指明变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本专利技术的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。这些调控序列包括但不局限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，数个)的氨基酸的多肽；其中该片段具有木葡聚糖内糖基转移酶活性。在一个方面中，片段包含成熟多肽的至少85％、至少90％、或至少95％的氨基酸残基。宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本专利技术的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。改进的特性：术语“改进的特性”意指与变体相关的与亲本相比得到改进的特征。在本专利技术中，改进的特性是相对于亲本，变体的增加的表达产量。增加的表达产量：术语“增加的表达产量”意指相对于在相同的培养条件下，培养每升表达亲本基因的相同的宿主细胞产生的分泌的活性酶的量(g)，来自培养每升表达变体基因的宿主细胞的培养基的分泌的活性酶的更高量(g)。在一个方面中，与亲本酶相比，该变体具有至少1.05、至少1.10、至少1.20、至少1.30、至少1.40、至少1.50、至少1.60、至少1.70、至少1.80、至少1.90、至少2、至少2.25、至少2.50、至少2.75、至少3.00、至少3.25、至少3.50、至少3.75、至少4、至少4.25、至少4.50、至少4.75、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、或至少10倍的增加的表达产量。分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其天然相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组体产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比编码该物质的基因天然相关的启动子强的启动子)。成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面中，基于预测SEQIDNO:2的氨基酸1至20是信号肽的SignalP3.0程序(本特森(Bendtsen)等人，2004，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)340:783-795)，该成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸21至292。在另一个方面中，基于预测SEQIDNO:4的氨基酸1至27是信号肽的SignalP3.0程序，该成熟多肽是SEQIDNO:4的氨基酸28至287。在另一个方面中，基于预测SEQIDNO:6的氨基酸1至22是信号肽的SignalP3.0程序，该成熟多肽是SEQIDNO:6的氨基酸23至294。在另一个方面中，基于预测SEQIDNO:8的氨基酸1至24是信号肽的SignalP3.0程序，该成熟多肽是SEQIDNO:8的氨基酸25至297。在另一个方面中，基于预测SEQIDNO:10的氨基酸1至22是信号肽的SignalP3.0程序，该成熟多肽是SEQIDNO:10的氨基酸23至294。在另一个方面中，基于预测SEQIDNO:12的氨基酸1至26是信号肽的SignalP3.0程序，该成熟多肽是SEQIDNO:12的氨基酸27至285。在另一个方面中，基于预测SEQIDNO:14的氨基酸1至22是信号肽的SignalP3.0程序，该成熟多肽是SEQIDNO:14的氨基酸23至323。在另一个方面中，基于预测SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种木葡聚糖内糖基转移酶变体，该变体包括与SEQ ID NO:2的全长多肽的位置10、30、40、51、53、60、99、102、117、130、136、157、162、175、183、254、以及280相对应的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有木葡聚糖内糖基转移酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、或50的成熟多肽序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.20 US 62/039,7441.一种木葡聚糖内糖基转移酶变体，该变体包括与SEQIDNO:2的全长多肽的位置10、30、40、51、53、60、99、102、117、130、136、157、162、175、183、254、以及280相对应的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有木葡聚糖内糖基转移酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、或50的成熟多肽序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。2.如权利要求1所述的变体，该变体是亲本木葡聚糖内糖基转移酶的变体，其中该亲本选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，该多肽与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、或50的成熟多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少60％、至少80％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；(b)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下、中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与(i)SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、或49的成熟多肽编码序列或者(ii)(i)的全长互补体杂交；(c)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、或49的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少60％、至少80％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；以及(d)SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、或50的成熟多肽的片段，该片段具有木葡聚糖内糖基转移酶活性。3.如权利要求2所述的变体，该变体与该亲本木葡聚糖内糖基转移酶的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列一致性。4.如权利要求1-3中任一项所述的变体，其中取代的数目是1-17个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个取代。5.如权利要求1-4中任一项所述的变体，该变体包括选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：I10A；P30E；A40G；S51T；I53A,V；Y60S；T99E,N；E102G；Q117E；K130R；R136W；Y157H；Y162C；N175S,G,Q；F183I；A254E；以及S280G,E。6.如权利要求5所述的变体，该变体包括A40G+N175...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·赫尔德，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK