拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域ｃＤＮＡ序列及其克隆方法，涉及一种ｃＤＮＡ序列。提供一种拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域ｃＤＮＡ序列及其克隆方法。拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域ｃＤＮＡ序列是从拟穴青蟹脑组织中得到的ＰＤＩ＿ａ＿ＰＤＩ＿ａ′＿Ｃ保守区域的ｃＤＮＡ序列，它具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １所示的序列。从拟穴青蟹克隆ＰＤＩ＿ａ＿ＰＤＩ＿ａ′＿Ｃ保守区域ｃＤＮＡ的方法包括：从拟穴青蟹的脑组织中提取总ＲＮＡ；以拟穴青蟹脑组织总ＲＮＡ为模板进行ｃＤＮＡ第一链合成；利用保守区域特异性引物和３’ＲＡＣＥ引物进行ＲＴ－ＰＣＲ反应；ＰＤＩ保守区域的基因克隆和测序：ｃＤＮＡ片段的序列分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种cDNA序列，尤其是涉及一种拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域基因 及其克隆方法。技术背景蛋白二硫键异构酶(PDI)是真核生物中广泛存在的一类蛋白，主要集中于内质网中，在 大部分组织和器官中以组成型表达。细胞内粗面内质网越多，结构越复杂，分布越密集，PDI 的含量及活性也就越高。PDI能通过催化分泌蛋白二硫键的形成、断裂和重排以帮助底物获 得正确的构象，但同时也发现该蛋白没有底物特异性，并且对那些不具备二硫键的蛋白也能 指导其正确折叠和分泌，所以PDI兼具分子伴侣和酶的特性(见文献1 、 Noiva R， Lennarz WJ. Protein disulfide isomerase. A multifunctional protein resident in the lumen of the endoplasmic reticulum . Biological Chemistry, 1992, 267(6):3553—3556; 2、 Freedman RB， Hirst TR, Tuite MR Protein disulphide isomerase: building bridges in protein folding. Trends Biochem Sci, 1994, 19(8):331 — 336)。象这样的一类分子被称为折叠酶(foldase)， PDI是目前发现仅有的两种折叠 酶之一，故而有着较高的研究价值。除了在酶化学、分子伴侣和结构生物学上的研究意义以 外，PDI还和包括酵母生孢反应、T细胞抗原呈递、前胶原成熟加工等多种生物过程有关， 甚至还构成了另一些酶的亚基，如人脯氨酰-4-羟化酶p亚基(见文献3、TainaP, TarjaH， Kaisa T, et al. Molecular cloning of the P-subunit of human prolyl 4-hydroxylase. This subunit and protein disulphide isomerase are products of the same gene . The EMBO Journal, 1987,6(3): 643 — 649)。此外由于二硫键的形成是许多蛋白折叠途径中的限速步骤，PDI在应用开发方面也极 具价值，如在抗体突变研究中，作为无细胞翻译体系的添加物，PDI蛋白可以极大地改善反 应效率和实验效果。又如在酵母中表达外源分泌蛋白时，通过提高PDI的表达水平，可望将 目的蛋白的表达和分泌提高数十倍，这一点尤其具有经济价值(见文献4、 RobineonA,Hines V, Wittrup K. Protein disulfide isomerase over expression increases secretion of foreign proteins in Sac-charomyces cerevisiae. Biotechnology, 1994, 12:381—384)。PDI由6个保守区域(a， e， b， b'， a'， c)组成，其中a和a'区与硫氧还蛋白家族同源(见 文献5、 Edm肌JC, Ellis L, Blacher RW， et al. Sequence of protein disulphide isomerase and implications of its relationship to thioredoxin. Nature ,1985，317:267 — 270)，都含有独立的具有异构酶活性的催化位点-CGHC-(见文献6、 Vuori K， Pihlajaniemi T， MyllylaR, et al. Site-directed mutagenesis of human protein disulphide isomerase: effect on the assembly, activity and endoplasmic reticulum retention of human prolyl 4-hydroxylase in Spodoptera frugiperda insect cells. The EMBO Journal, 1992, 11(11): 4213—4217; 7、 Reiko U, Tsuneyuki O， Hiroshi I, et al. Functions of Characteristic Cys-Gly-His-Cys (CGHC) and Gln-Glu-Asp-Leu (QEDL) Motifs of Microsomal ER-60 Protease . Biochem. 1997,122:834—842)。PDI_a—PDI—a'_C保守区域(NCBI编号cd02995)是属于PDIa家族C端硫氧还原蛋白(a，) 亚家族。该保守区域除了参与构成PDI还参与构成ERp72， ERp57(或ERp60)和EFP1 C端 氧化还原活性区域(见文献8、 Walker KW， Lyles MM, Gilbert HF. Catalysis of oxidative protein folding by mutants of protein disulfide isomerase with a single active-site cysteine. Biochemistry, 1996,35(6):1972 —1980; 9、 N0rgaard P, Winther J R. Mutation of yeast Euglp CXXS active sites to CXXC results in a dramatic increase in protein disulphide isomerase activity. Biochem,2001， 358(1):269—274; 10、 Lappi AK, Lensink MF， Alanen HI, et al. A conserved arginine plays a role in the catalytic cycle of the protein disulphide isomerases. J. Mol. Biol" 2004， 335(1):283—295)。早 前对PDI及其众多同源蛋白的报道涵盖了从线形动物、节肢动物到鱼类、两栖类、鸟类、哺 乳类，还包括很多植物和真菌(NCBI GenBank)。在节肢动物门中，昆虫纲中果蝇的PDI基 因已被深入研究(见文献11 、 McKay RR, Zhu L, Shortridge RD. A Drosophila gene that encodes a member of the protein disulfide isomerase/phospholipase C-alpha family. Insect Biochem Mol Biol, 1995,25(5):647 _654 )，但在甲壳纲仅见桡足亚纲的鲑疮痂鱼虱(Z^eop/^ezV^ ra/附o"本文档来自技高网...
【技术保护点】
拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域ｃＤＮＡ序列，其特征在于ＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＡＡＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＴ６０ＧＴＣＴＴＧＡＴＡＧＡＧＴＴＣＴＡＴＧＣＴＣＣＴＴＧＧＴＧＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧＧＣＣＣＣＡＡＣＣＴＡＣ１２０ＧＡＴＧＡＧＴＴＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＧＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴ１８０ＧＣＣＡＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＴＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＣＣＴＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡ２４０ＧＣＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＴＡＡＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＴＧＡＣＴＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＴ３００ＡＴＴ３０３ａ）序列特征：＊长度：３０３碱基对＊类型：核酸＊链型：双链＊拓扑结构：线性ｂ）分子类型：ｃＤＮＡｃ）假设：否ｄ）反义：否ｅ）最初来源：拟穴青蟹（Ｓｃｙｌｌａｐａｒａｍａｍｏｓａｉｎ）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：叶海辉，刘元婧，杨玉荣，黄辉洋，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]
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