一种亚油酸异构酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种亚油酸异构酶突变体及其应用，所述突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的亚油酸异构酶第62位蛋氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸，和/或第295位丝氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸得到。本发明专利技术亚油酸异构酶突变体与野生型酶相比，催化亚油酸获得反‑10,顺‑12共轭亚油酸的酶活力得到了大大的提高，特别是双突变时，如M62A/S295L，M62A/S295A，M62A/S295V，M62G/S295L，M62G/S295A，M62G/S295V，能够提高10倍左右，具备良好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种亚油酸异构酶突变体及其应用(一)
本专利技术涉及一种亚油酸异构酶突变体及其应用。(二)
技术介绍
共轭亚油酸(Conjugatedlinoleicacid，CLA)是具有共轭双键的十八碳二烯酸的统称，具有抗癌、抗氧化、抗心血管疾病及减轻体重的作用。美国FDA于2008年、欧洲国家2012年批准CLA作为食品添加剂使用，我国2009年批准CLA为新资源食品，市场需求巨大。反刍动物肉、奶及其制品是CLA的天然食物来源，但含量较低。CLA也可以以亚油酸(linoleicacid；LA)为底物，通过碱催化异构化反应化学生成，但产物是c-9,t-11CLA和t-10,c-12CLA的两种异构体的混合物，分离、纯化困难，且产物中混有对食用具有安全隐患的脂肪酸环化副产物。自然界中某些微生物含有亚油酸异构酶(LinoleateIsomerase,PAI)，来源于痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)的PAI是目前唯一已知晶体结构的亚油酸异构酶，能催化LA为t-10,c-12CLA。目前已经有一些研究借助基因工程技术构建具有产PAI活力的工程菌株，但酶活力均不够理想，达不到工业应用的水平。基于对蛋白质晶体结构认识基础上的酶蛋白质定向进化技术在酶工程领域已有大量的研究和应用，通过对酶蛋白活性中心相应氨基酸残基的突变，再进行筛选，可以获得催化活性显著提高的突变酶，因此，可以利用该基因改造技术提高PAI的催化活性。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种亚油酸异构酶突变体及其应用，该亚油酸异构酶突变体具有很好的催化亚油酸合成共轭亚油酸的活力，具有良好的工业应用前景。野生型亚油酸异构酶(PAI；GeneBank号为AX062088)来源于痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)，但野生型亚油酸异构酶催化亚油酸获得反-10,顺-12共轭亚油酸(trans-10,cis-12conjugatedlinoleicacid；t-10,c-12CLA)的活性较弱，目前还不具备实际工业应用价值。如果能够通过基因工程改造，提高其酶活性，则其具备相应的工业应用价值。本专利技术采用的技术方案是：通过对野生型亚油酸异构酶活性区域进行理性设计并定点突变，对多个位点进行饱和定点突变，再表达纯化后进行酶活力进行检测，本专利技术提供一种亚油酸异构酶突变体，所述突变体由氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的亚油酸异构酶第62位蛋氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸，和/或第295位丝氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸得到。进一步，所述突变体是将第62位蛋氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸，同时第295位丝氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸。组合后产生的6种双突变酶，经检测酶活力能够提高10倍左右，具有良好的工业应用前景。为了方便本专利技术亚油酸异构酶突变体表达后的纯化，优选的，所述的亚油酸异构酶突变体的N端或C端连接有用于蛋白纯化的标签。更优选的，所述标签为组氨酸标签。组氨酸标签本身较小，一般常用6个组氨酸，且纯化步骤方便。本专利技术还提供一种所述亚油酸异构酶突变体的编码基因，由所述编码基因构建的重组载体，以及由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。此外，本专利技术还提供一种所述亚油酸异构酶突变体在催化亚油酸制备共轭亚油酸中的应用，具体所述的应用为：以含亚油酸异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的培养液超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以亚油酸为底物，以吐温-80为助剂，于pH6.7、25mM磷酸缓冲液中，40℃水浴搅拌反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(10E,12Z)-共轭亚油酸。所述催化剂用量以缓冲液体积计为250～4000U/ml(优选314U/ml)，所述底物用量以缓冲液体积计为50～150g/L(优选125g/L)，所述助剂体积用量以缓冲液体积计为5-15％(优选12.5％)。进一步，所述催化剂按如下方法制备：(1)将含亚油酸异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌接种于LB固体平板，37℃培养18小时，挑取重组转化子并接种于LB固体培养基，37℃培养18小时，获得重组转化子；所述LB液体培养基质量组成为：1％蛋白胨、0.5％酵母浸出粉、1％氯化钠，溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基即在LB液体培养基的基础上添加质量浓度1.5％琼脂粉；(2)将重组转化子接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃、200rpm摇床中震荡培养，至OD600达到0.4～0.5，获得种子液；(3)将种子液以体积百分浓度1％的接种量接种于自诱导培养基中，25℃培养48小时，将培养液超声波破碎至镜检无细胞，离心后获得上清，即为粗酶液；自诱导培养基组成为：阿拉伯糖3g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸盐6.8g/L，硫酸盐1.2g/L，NH4Cl2.65g/L，MgSO40.98g/L，CaCl20.1g/L，溶剂为水，pH值自然；(4)以缓冲液A先平衡蛋白质Ni+柱后，加入步骤(3)制备的粗酶液，充分摇荡30min，放掉废液，以缓冲液A冲洗三次后，加入缓冲液B充分摇荡均匀20min，后收集流出液，流出液中加入过量硫酸铵至无法溶解，离心3000rpm，10min，收集沉淀，沉淀中加入质量浓度15％甘油水溶液溶解，获得蛋白溶液；蛋白溶液过以g25为填料的层析柱脱盐，检测流出液的A280吸收值，收集A280吸收值大于0.1的部分，获得纯酶；缓冲液A：NaCl140mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO41.8mmol/L，以5MNaOH调节pH值至8.0，溶剂为水；缓冲液B：NaH2PO4·2H2O50mM，NaCl300mM，咪唑(imidazole)500mM，以5M盐酸溶液调节pH值至8.0，溶剂为水。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术亚油酸异构酶突变体与野生型酶相比，催化亚油酸获得反-10,顺-12共轭亚油酸的酶活力得到了大大的提高，特别是双突变时，如M62A/S295L，M62A/S295A，M62A/S295V，M62G/S295L，M62G/S295A，M62G/S295V，能够提高10倍左右，具备良好的工业应用前景。(四)附图说明图1为亚油酸异构酶催化亚油酸获得反-10,顺-12共轭亚油酸的示意图。图2为纯化后亚油酸异构酶SDS-PAGE图谱。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1野生型亚油酸异构酶(PAI；GeneBank号为AX062088)，但野生型亚油酸异构酶的酶活力较低，不能很好地满足工业应用的要求。野生型亚油酸异构酶氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，以含有该野生型亚油酸异构酶基因(核苷酸序列如SEQIDNO：2所示)的PET28a重组质粒(带有组氨酸标签)为模板，在M62，S295位点进行饱和突变。因此利用oligo7软件设计平末端引物，后进行PCR定点突变，引物如表1所示，其中M62-R和S295-R为反向引物，其余均为正向引物，其中每个位点的反向引物相同，正向引物中前三个碱基为突变位点。本次PCR突变采用KOD-Plus-NeoDNA聚合酶试剂盒(购买来自东洋纺本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种亚油酸异构酶突变体，其特征在于所述突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的亚油酸异构酶第62位蛋氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸，和/或第295位丝氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸得到。

【技术特征摘要】
1.一种亚油酸异构酶突变体，其特征在于所述突变体由氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的亚油酸异构酶第62位蛋氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸，和/或第295位丝氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸得到。2.如权利要求1所述亚油酸异构酶突变体，其特征在于所述突变体是将第62位蛋氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸，同时第295位丝氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸。3.如权利要求1所述亚油酸异构酶突变体，其特征在于所述突变体的N端或C端连接有用于蛋白纯化的组氨酸标签。4.一种权利要求1所述亚油酸异构酶突变体的编码基因。5.一种由权利要求4所述编码基因构建的重组载体。6.一种由权利要求5所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。7.一种权利要求1所述亚油酸异构酶突变体在催化亚油酸制备(10E,12Z)-共轭亚油酸中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含亚油酸异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的培养液超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以亚油酸为底物，以吐温-80为助剂，于pH6.7、25mM磷酸缓冲液中，40℃水浴搅拌反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(10E,12Z)-共轭亚油酸。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以缓冲液体积计为250～4000U/ml，所述底物用量以缓冲液体积计为50～150g/l，所述助剂体积用量以缓冲液体积计为5-15％。10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：(1)将含亚油酸异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪君，崔茂林，陈振明，周硕，赖敦岳，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33