人血管内皮生长因子165b与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备制造技术

人血管内皮生长因子165b(hVEGF165b)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白及其制备技术的发明专利技术属于长效重组融合蛋白技术领域。本发明专利技术的融合蛋白包括与人血管内皮生长因子165b至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区。利用限制性酶切连接的方法将hVEGF165b与HSA拼接，中间不加入任何连接肽。该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入，它们在保留了hVEGF165b活性的基础上，可望显著延长在体内的半衰期，是药学领域中，能够替代hVEGF165b的，有良好前景的药用融合蛋白。

【技术实现步骤摘要】

人血管内皮生长因子16 与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备属于长效重组融 合蛋白药物
涉及DNA重组技术，药物蛋白与HSA的融合使得药物成为长效药物。
技术介绍
血管内皮生长因子(vascularendothelium growth factor，VEGF)是血管内皮细 胞的特异丝裂原，1989年由!^errara等在牛垂体滤泡星形胶质细胞体外培养液中分离纯化 出来的，具有细胞质的钙聚集作用，促进血管内皮细胞增殖，诱导血管生成，增加血管通透 性，血管保护等生物学作用。人的VEGF基因位于染色体的6p21. 3，编码VEGF的基因长141Λ，由8个外显子和 7个内含子交替组成，分子量35 45kD。VEGF根据VEGFmRNA剪接方式不同分为多个变构 体，有 VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189 和 VEGF206。VEGF165 以同源二聚体的 形式存在，糖基化的VEGF165 二聚体相对分子质量约为45000，非糖基化的相对分子质量约 为43000。血管内皮生长因子165(VEGF16Q是目前发现的最重要的肿瘤血管形成促进剂之 一，具有促血管形成和增加血管通透性的双重功能，在肿瘤的发展和转移中起着重要作用。近来又发现一种内源性剪接变构体，即VEGF165b.其与VEGF165区别仅在于编码 的末端六个氨基酸的差异。多存在于正常细胞、组织及血液循环中，尤其在具有高水压传导 性的组织如脉络丛以及肾小囊足细胞中(目前所检测的有前列腺癌及肾细胞癌)表达水平 却很低，VEGFie^3能抑制VEGF165介导的内皮细胞增殖和在血管中迁移和血管舒张前的迁 移，从而抑制肿瘤的生长，将有很大的临床应用价值。在肿瘤的治疗上，已有很多抗血管生成的药物问世，包括反义寡核苷酸，可溶 性VEGF受体类似物，小分子VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂如STO416、SU11248, PTK787/ 3(222584等，但效果不是十分有效，并且其单克隆抗体常有免疫原性，而那些人工合成的小 分子物质常存在不可预知的副作用，因此，VEGF165b作为内源性抑制剂剪接变构体在临床 应用上显示出美好前景。由于hVEGF16^分子量非常小，体内代谢速度相当快，因此为了达到治疗效果，需 要频繁大剂量用药。昂贵的价格和频频用药造成的不便将严重限制了此种药物的应用。人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是血浆中的主要蛋白成分，它除了具 有维持血浆渗透压功能以外，还能担当许多内源因子和外源药物的载体，从而调节激素活 性，所载物质的毒性，以及药物的利用度。成熟的HSA有585个氨基酸残基组成，含有17对 二硫键，分子量约为66. 5KDa，如此大的分子量减小了它在内循环时经肾排泄的量，再正常 情况下，不易被肾小球虑过，血浆半衰期在20天左右。同时，HSA在人体内没有酶学和免疫 学活性，是一种理想的生物活性蛋白载体。
技术实现思路
本专利技术的一个内容是提供hVEGF16^与HSA生理特性于一体的人血管内皮生长因 子16 与人血清白蛋白的融合蛋白，该融合蛋白在保持了人血管内皮生长因子16 生理 特性的基础上，增加了作用位点，延长了体内半衰期，改善了溶解度，具有优良的药学特性。该融合蛋白的基因序列及氨基酸序列如前所述。本专利技术的技术方案在前期的研究中本实验室保藏了重组质粒PIC9K_hVEGF165 以及pBluescript-HSA质粒。pBluescript-HSA质粒上只有一个Bsu3611酶切位点在HSA末 端，设计含有HSA Bsu361I酶切位点及下游表达区序列的hVEGF16^上游引物和含有NotI 酶切位点以及hVEGF16^3与hVEGF165不同的6个末端氨基酸对应的碱基的下游引物，扩增 得到hVEGF16^3基因，然后通过限制性双酶切置入HSA下游，获得HSA-hVEGF16^融合基 因，中间不含任何连接肽序列。将该融合基因插入到克隆载体，转化到宿主系统，融合基因 就会整合到宿主的染色体中进行表达。如此一来，我们制备的人血管内皮生长因子16 与人血清白蛋白的融合蛋白，包 括与人血管内皮生长因子16 至少85%序列同源的二联体的第一区和与人血清白蛋白至 少85%序列同源的第二区；所述的与人血管内皮生长因子16 至少85%序列同源的二联 体的第一区位于融合蛋白的C末端，与人血清白蛋白至少85%序列同源的第二区位于融合 蛋白的N末端，中间不加任何连接肽；或所述的与人血管内皮生长因子16 至少85%序列 同源的二联体的第一区位于融合蛋白的N末端，与人血清白蛋白至少85%序列同源的第二 区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。优选的是所述的融合蛋白包括与人血清 白蛋白至少95%序列同源的第一区和与人血管内皮生长因子16 至少95%序列同源的第 二区。所述的融合蛋白包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人血管内皮 生长因子16 氨基酸残基序列相同的第二区，或上述两区的功能等同物。所述的功能等同 物是在不改变所述的融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白的个别氨基酸的残基的取代、缺 失或加入得到的多肽。本专利技术hVEGF16^3和HSA之间不加任何连接肽，可以避免因连接肽的加入而带来 的融合蛋白稳定性和免疫源性方面的问题。本专利技术的第二个内容是提供表达该融合蛋白编码区的宿主和携带该融合蛋白编 码区的重组表达载体。表达融合蛋白的宿主可以是细菌、酵母、动物细胞或植物细胞。表达出来的融合蛋 白可以存在于宿主细胞内，也可以从宿主细胞中分泌出来；分泌所用的信号肽可以是天然 的人血清白蛋白的信号肽，也可以是酿酒酵母阿尔法交配因子的信号肽，或者这两种信号 肽的类似物；目的基因可以被整合到宿主的染色体中，也可以插入到质粒中。本专利技术优选的 宿主系统是酵母表达系统，优选的酵母表达系统是毕赤酵母表达系统，优选的毕赤酵母表 达系统是GS115和X33。这种表达系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要 求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量 的重组蛋白。与宿主对应的表达载体大多可以购买商品化的，如毕赤酵母表达系统对应的载 体，分泌型的有 PPIC9K、pHIL-Sl、pPICZa、pYAM75P6，胞内型有 pPIC3K、pPICZ、pHWOlO、 pGAPZ.pGAPZa等。优选的是毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K，它是酵母整合载体，带有组氨酸缺陷型的选择性标记基因HIS4、AOXl启动子、MFa分泌信号肽和G418抗性基因等元 件。AOXl (醇氧化酶操纵子)5’序列、3’序列用于方便编码基因整合至酵母基因组和控制 编码基因的表达。转化带有融合cDNA的表达载体到宿主细胞中，可以用锂盐法、PEG法、原生质体 法、电穿孔法或化学转化等方法。转化之后，可以用多种方法鉴定是否成功，如提取基因组 DNA进行PCR鉴定，或者对细胞培养上清中的蛋白进行HSA抗体和hVEGF16^多抗检测。生产本专利技术的融合蛋白可以通过培养带有本专利技术构件的DNA的宿主系统来进行， 具体的培养方法可以用摇瓶或生物反应器。培养分为两个阶段宿主系统生长阶段和融合 蛋白合成阶段。之后本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．ｈＶＥＧＦ１６５ｂ与人血清白蛋白的融合蛋白的基因序列和蛋白质序列，如下：（１）基因序列：ＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣＧＧＴＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＡＧＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＴＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＴＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＴＣＣＡＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＧＴＡＡＡＡＴＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＡＧＴＡＡＣＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＧＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＴＣＡＣＴＴＣＡＴＡＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＣＡＧＴＴＧＣＡＡＣＴＣＴＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＧＡＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＣＣＣＣＣＧＡＴＴＧＧＴＧＡＧＡＣＣＡＧＡＧＧＴＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＴＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＴＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＴＡＴＡＴＧＡＡＡＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＴＴＡＴＧＣＣＣＣＧＧＡＡＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＡＡＡＡＧＧＴＡＴＡＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＧＴＴＧＣＣＡＡＡＧＣＴＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＴＣＧＴＣＴＧＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＧＴＧＴＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＧＣＡＴＧＧＧＣＡＧＴＡＧＣＴＣＧＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＡＧＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＧＴＴＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＡＧＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＡＡＴＧＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＡＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＡＴＣＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＧＡＴＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＴＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＴＴＧＣＣＴＴＣＡＴＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＣＴＧＡＧＧＣＡＡＡＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＧＡＡＴＡＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＡＣＴＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＣＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＣＡＣＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＡＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＴＴＴＴＴＧＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＡＧＴＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＣＴＡＴＴＡＧＴＴＣＧＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＴＡＣＣＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＣＴＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＣＴＡＴＣＴＡＴＣＣＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＴＡＡＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＴＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＧＣＧＡＣＣＡＴＧＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＴＧＡＡＡＣＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＡＴＧＣＡＣＡＣＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＣＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡＡＣＴＧＣＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＴＴＡＴＧＧＡＴＧＡＴＴＴＣＧＣＡＧＣＴＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＧＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＧＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＣＧＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＡＴＧＴＣＴＡＴＣＡＧＣＧＣＡＧＣＴＡＣＴＧＣＣＡＴＣＣＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＴＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＴＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＣＴＧＡＴＧＣＧＡＴＧＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱瑞宇，金坚，辛鑫，臧娴，戴慧云，张大成，雷楗勇，陈蕴，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32