通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)的天然反义转录子治疗VEGF相关的疾病制造技术

寡核苷酸化合物调节血管内皮生长因子(VEGF)多核苷酸和其编码产物的表达和/或功能。治疗与血管内皮生长因子(VEGF)有关的疾病的方法包括给予患者为抑制VEGF天然反义转录子而设计的一种或多种寡核苷酸化合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)的天然反义转录子治疗VEGF相关的疾病交叉引用本申请要求2008年12月4日提出的美国临时申请61/119,957的优先权，通过引用将该申请整体并入本文。专利
本专利技术的实施方案包括调节VEGF和相关分子的表达和/或功能的寡核苷酸。背景DNA-RNA和RNA-RNA杂交对核酸功能的许多方面(包括DNA复制、转录和翻译)是重要的。杂交对于检测特定核酸或改变其表达的多种技术也很重要。例如，反义核苷酸通过和靶RNA杂交从而干扰RNA剪接、转录、翻译和复制而破坏基因表达。反义DNA还具有DNA-RNA杂交体作为核糖核酸酶H消化(大多数细胞类型中存在的活动)的底物的额外特征。反义分子可以被送入细胞(如在寡脱氧核苷酸(ODN)的例子中)，或者它们可由内源基因表达为RNA分子。FDA最近批准了一种反义药——VITRAVENETM(用于治疗巨细胞病毒视网膜炎)，这反映反义有治疗实用性。概述本概述用于介绍本专利技术的概况，以简要指明本专利技术的实质和内容。它随着下列理解而提出，即不能将它用于解释或限制权利要求的范围或含义。在一个实施方案中，本专利技术提供通过使用反义寡核苷酸抑制天然反义转录子作用的方法，所述反义寡核苷酸靶向天然反义转录子的任何区域，导致相应有义基因的上调。本文还预期天然反义转录子的抑制可以通过siRNA、核酶和小分子来实现，这些也被认为在本专利技术的范围内。一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织里的VEGF多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括使所述细胞或组织与5-30个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触，从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的VEGF多核苷酸的功能和/或表达，其中所述寡核苷酸与包含SEQIDNO：2的核苷酸1-643或SEQIDNO：3的核苷酸1-513(图3)内的5-30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补具有至少50％序列同一性。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸靶向VEGF多核苷酸的天然反义序列(例如SEQIDNO：2和3中展示的核苷酸)，及其任何变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的实例如SEQIDNO：4-9(图4)所展示。另一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中的VEGF多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括：使所述细胞或组织与5-30个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触，从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的VEGF多核苷酸的功能和/或表达，其中所述寡核苷酸与VEGF多核苷酸的反义的反向互补具有至少50％序列同一性。另一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中的VEGF多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括：使所述细胞或组织与5-30个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触，从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的VEGF多核苷酸的功能和/或表达，其中所述寡核苷酸与VEGF反义多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50％序列同一性。在一个优选的实施方案中，组合物包含与有义和/或反义VEGF多核苷酸结合的一种或多种反义寡核苷酸。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个修饰的或取代的核苷酸。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个修饰的键。在另一个实施方案中，修饰的核苷酸包含修饰的碱基，其包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’-O-甲基、氟代或碳、亚甲基或其它锁定核酸(LNA)分子。优选修饰的核苷酸是锁定核酸分子，包括α-L-LNA。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸通过皮下、肌内、静脉内或腹膜内给予患者。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸以药物组合物给药。治疗方案包括给予患者至少一次反义化合物；但是，该治疗可改为在一段时间内包括多次给药。该治疗可以结合其它一种或多种类型的疗法。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸包裹于脂质体内或依附于载体分子(例如胆固醇、TAT肽)。以下介绍其它方面。附图简述图1：图1A和1B为实时PCR结果图，其显示相对于对照，HepG2细胞用使用Lipofectamine2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理后，VEGFmRNA的倍数改变和标准差。实时PCR结果表明，用针对vegfaas设计的siRNA之一(vefaas1_2，P＝0.05)并可能用第二条：vefaas1_3(P＝0.1，图1A)处理后48小时，HepG2细胞中的VEGFAmRNA的水平显著升高。在相同的样品中，用vefaas1_2或vefaas1_3处理后，vegfaasRNA的水平显著降低，但是用vefaas1_5处理后不变，vefaas1_5也对VEGFAmRNA水平没有影响(图1B)。标示为vegfas1_2、vegfas1_3、vegfas1_5的柱分别对应于用SEQIDNO4、5和6处理的样品。图1C：图1为实时PCR结果图，其显示相对于对照，HepG2细胞用使用Lipofectamine2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理后，VEGFmRNA的倍数改变和标准差。实时PCR结果表明，用针对vegRas设计的siRNA中的两条(vegRas1_2，P＝0.02和vegRas1_3，P＝0.06)处理后48小时，HepG2细胞中的VEGFAmRNA的水平显著升高。vegRasRNA水平改变的结果待定。标示为vegRas1_2、vegRas1_3、vegRas1_5的柱分别对应于用SEQIDNO7、8和9处理的样品。图2显示SEQIDNO：1：人血管内皮生长因子(VEGF)，转录子变体1，mRNA(NCBI注册号：NM_001025366.1)和SEQIDNO：1a显示VEGF的基因组序列(外显子显示为大写字母，内含子显示为小写字母)。图3显示SEQIDNO：2：VEGF天然反义序列(NCBI注册号：BI045995)SEQIDNO：3：VEGR天然反义序列(NCBI注册号：BF829784)图4显示针对VEGF天然反义序列设计的反义寡核苷酸，SEQIDNO：4-6。图5显示针对VEGR天然反义序列设计的反义寡核苷酸，SEQIDNO：7-9。图6显示靶序列VEGFA外显子1(SEQIDNO：10)；由AppliedBiosystemsTaqmanGeneExpressionAssay(Hs00173626_m1)设计的定制试验的正向引物序列(SEQIDNO：11和12)、反向引物序列(SEQIDNO：13和14)和报道序列(SEQIDNO：15和16)。专利技术详述为了说明，下面参考实例应用来描述本专利技术的几个方面。应当理解，所阐释的许多具体细节、关系和方法是为了提供本专利技术的完整理解。但是，相关领域的普通技术人员容易认识到本专利技术无需一个或多个具体细节或与其它方法一起也可以实施。本专利技术不受行为或事件顺序的限制，因为某些行为可按不同的顺序出现和/或与其它行为或事件一起出现。另外，为了实施根据本专利技术的方法并不需要所有说明的行为或事件。本文公开的所有基因、基因名和基因产品旨在和来自本文公开的组合物和方法所适用的任何种类的同系物相应。因此，所述术语包括但不限于来自人和小鼠的基因和基因产品。应当理解当来自特定物种的基因和基因产品被公开时，该公开旨在仅仅举例，不应理解为限制，除非它所在的上下文清楚指明。因此，例如，本文本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种在体内或体外调节患者细胞或组织中的血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）多核苷酸的功能和／或表达的方法，所述方法包括：使所述细胞或组织与５－３０个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触，从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）多核苷酸的功能和／或表达，其中所述寡核苷酸与包含ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２的核苷酸１－６４３或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３的核苷酸１－５１３（图３）内的５－３０个核苷酸的多核苷酸的反向互补具有至少５０％序列同一性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US61/1199572008年12月4日1.靶向血管内皮生长因子(VEGF)多核苷酸的天然反义区域的反义寡核苷酸在制备用于在体内或体外上调患者细胞或组织中的具有SEQIDNO：1的血管内皮生长因子(VEGF)多核苷酸的功能和/或表达的药物中的用途，其中所述天然反义由SEQIDNO：2或3组成，且其中所述反义寡核苷酸选自SEQIDNOS：4、5、7和8。2.权利要求1的用途，其中相对于对照，在体内或体外增大血管内皮生长因子(VEGF)的表达和/或功能，其中所述对照指未用所述反义寡核苷酸处理的细胞或组织。3.权利要求1的用途，其中所述反义寡核苷酸靶向SEQIDNO：2的天然反义序列。4.权利要求1的用途，其中所述反义寡核苷酸靶向对于血管内皮生长因子(VEGF)多核苷酸的编码和/或非编码核酸序列反义的天然反义序列。5.权利要求1的用途，其中所述反义寡核苷酸靶向与血管内皮生长因子(VEGF)多核苷酸具有重叠和/或非重叠序列的天然反义多核苷酸。6.权利要求1的用途，其中所述反义寡核苷酸包含一种或多种修饰，所述修饰包含：修饰的糖部分、修饰的核苷间键合、修饰的核苷酸和/或它们的组合。7.权利要求6的用途，其中所述修饰的糖部分包含：2′-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2′-甲氧基修饰的糖部分、2′-O-烷基修饰的糖部分或二环糖部分。8.权利要求6的用途，其中所述修饰的核苷间键合包含：硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲酯和/或它们的组合。9.权利要求6的用途，其中所述寡核苷酸任选具有至少一个修饰的核苷酸，所述核苷酸包括：肽核酸、锁定核酸(LNA)分子、阿拉伯糖核酸(FANA)、肽核酸(PNA)、它们的类似物或衍生物。10.12-30个核苷酸长度的反义寡核苷酸在制备用于在体内或体外上调哺乳动物细胞或组织中的血管内皮生长因子(VEGF)基因表达和/或功能的药物中的用途，所述反义寡核苷酸对血管内皮生长因子多核苷酸的天然反义链的非编码和/或编码序列特异，其中所述血管内皮生长因子多核苷酸的天然反义序列由SEQIDNO：2或3组成，且其中反义寡核苷酸选自SEQIDNOS：4、5、7和8。11.一种合成的，修饰的10-30个核苷酸长度的寡核苷酸，其包含至少一种修饰，其中所述修饰包含至少一个以下核苷酸间键合：烷基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲酯或它们的组合，其中所述寡核苷酸是反义化合物，其与由SEQIDNO：2或3组成的血管内皮生长因子(VEGF)的天然反义多核苷酸杂交，且相对于对照在体内或体外上调血管内皮生长因子(VEGF)分子的表达和/或功能，其中所述对照指未用所述寡核苷酸处理的细胞或组织，且其中所述寡核苷酸选自SEQIDNOS：4、5、7和8。12.权利要求11的寡核苷酸，其中所述至少一种修饰包括硫代磷酸酯核苷酸间键合和选自下面的至少一个核苷酸间键合的组合：烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲酯和/或它们的组合。13.权利要求11的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键合。14.权利要求11的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键合的骨架。15.权利要求11的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸任选包含至少一个修饰的核苷酸，所述修...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·科拉德，
申请(专利权)人：欧科库尔纳有限责任公司，
类型：发明
国别省市：US