本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种从重组蛋白制品中提取残留DNA的磁珠法。本发明专利技术公开了一种从重组蛋白制品中提取残留DNA的磁珠法，其包括样品制备、酶切、DNA结合、DNA清洗和DNA洗脱的步骤，其特征在于所述酶切步骤：蛋白酶K与重组蛋白制品中蛋白质的质量比率至少为1：6，37℃孵育不少于10h；所述DNA洗脱步骤，70℃水浴不少于10min。与常规方法相比，本发明专利技术方法能将DNA回收率提高50％以上的，即使是痕量DNA(＜1pg)，其回收率也能超过70％，并能稳定在70％-130％之间，符合相关法规要求。该方法适用于重组蛋白制品制备过程的中间体和原液中残留DNA的提取，可用于监测纯化工艺去除外源DNA的能力，满足原液残留DNA批检验的要求，为重组蛋白制品中残留DNA的提取提供了有效的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种从重组蛋白制品中提取残留DNA的磁珠法。
技术介绍
随着生物医药技术的发展，越来越多的哺乳动物细胞用于生产重组蛋白质，比如单克隆抗体、细胞因子、激素、生长因子、其它还有某些酶类、凝血因子等。涉及到的治疗领域也越来越广泛，包括内分泌、心脑血管、外科、血液病、抗肿瘤等等。重组蛋白制品的用量随着临床治疗效果的需求也越来越大，由微克级上升到了毫克甚至克级。需长期重复用药的生物产品也越来越多。这使得我们技术审评部门不得不更加重视由于DNA残留所带来的安全性担忧。自从上世纪80年代末，利用杂交瘤技术和重组DNA技术生产的鼠源性单克隆抗体在各国被批准使用，管理当局就已经认识到这类产品的安全性问题。理论上，存在于生物制品中的微量的外源DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其它病理变化。当残留的DNA与制品一同注射到人体后，含有致癌基因的细胞DNA就可能诱发肿瘤的产生；如果含有某些可以整合的病毒的DNA，这种DNA还可以进入宿主细胞，表达后感染受体，导致一系列的不良后果。鉴于外源DNA对机体所具有的潜在危害，各国药品监督管理机构对生物制品中残留DNA的态度都十分谨慎，对生物制品中外源DNA残留量有着严格的限度控制，同时要求生物制药企业建立残留DNA检测方法，用于监测并验证纯化工艺去除该杂质的能力，及终产品残留DNA的检测与产品放行。美国FDA及我国SFDA均规定采用连续细胞系生产的纯化生物制品中宿主DNA残留量不得超过IOOpg/剂。目前，已有的残留DNA检测方法主要包括固相斑点杂交法、荧光法、DNA结合蛋白法及q-PCR法等。杂交法虽然价廉易得，但其仅为一限量方法，实验周期较长、步骤繁琐，有被其他方法取代的趋势。而其他3种定量方法又以q-PCR法为优，因其具有专一性强、灵敏度高、快速且可实现高通量等优点，该法正越来越被广泛应用于残留DNA的检测。采用q-PCR法需先提取样品中的残留DNA，而DNA的提取效率将直接影响后续的定量结果，因此，DNA的提取效率成为衡量该法准确度的重要指标之一。DNA提取效率常用DNA的回收率来表示，即先向样品中添加已知量DNA，再对样品中DNA进行提取和定量，通过计算DNA实际提取量与DNA已知量的比值得到DNA回收率。对于一个准确稳定的DNA提取方法，SFDA要求DNA回收率应在70% -130%之间。传统的DNA提取方法苯酚-氯仿法，虽然成本较低，但步骤繁琐、耗时长、DNA损失率高，难以实现从大量蛋白样品中对痕量DNA的有效提取。磁珠法为一种新型的DNA提取方法，可以从复杂的基质或样品中提取DNA，同时还可以对DNA进行浓缩，该方法方便快捷，整个实验仅需2-3小时即可完成。采用磁珠法提取重组蛋白制品中的DNA，其基本步骤及常规条件如下a)样品准备低吸附离心管加入100 μ I样品溶液，调节NaCl浓度至约O. 5Μ，调节pH至7-8之间；b)酶切向离心管中加70 μ I蛋白酶K溶液(3mg/ml)，56°C孵育30min。c) DNA结合酶切后向离心管中加360 μ I裂解液、30 μ I磁珠及300 μ I异丙醇，高速振荡5min，离心管快速离心15s，置于磁力架，静置至溶液澄清后小心移走液体；d)DNA清洗加入300 μ I清洗液，轻微振荡后快速离心，然后将离心管再放入磁力架，静置至溶液澄清，小心移走液体，重复上述清洗步骤一次；e)DNA洗脱待离心管中磁珠挥发干后，加50 μ I洗脱液，70°C水浴7min，其间每隔2-3min将离心管取出迅速振荡混匀，快速离心后，将离心管置于磁力架上，静置2_3min，小心转移液体至新的1. 5ml离心管中，高速离心> 14000g、3min，再次将离心管放入磁力架，转移DNA溶液至新的离心管中。采用上述方法条件对常规样品(如添加了 DNA的高浓度BSA溶液或缓冲液)中的DNA进行提取，即使添加的DNA量仅4pg，其回收率仍能达到70%以上。然而同样的方法条件对重组蛋白制品，特别是高浓度的重组蛋白制品中DNA进行提取时，即使添加的DNA量高达40pg，所得的DNA回收率也不足30%，准确度无法达到相关法规要求。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题采用现有磁珠法提取重组蛋白制品中DNA时DNA回收率偏低的问题。 为此，本专利技术公开了一种从重组蛋白制品中提取残留DNA的磁珠法，其包括样品制备、酶切、DNA结合、DNA清洗和DNA洗脱的步骤，其特征在于所述酶切步骤蛋白酶K与重组蛋白制品中蛋白质的质量比率至少为(不少于)1 6，37°C孵育不少于IOh ;所述DNA洗脱步骤，70°C水浴不少于lOmin。在一些实施例中，所述重组蛋白制品为单克隆抗体、细胞因子、激素、生长因子、酶类、或凝血因子中之一；其中优选单克隆抗体或单克隆抗体的中间体及原液。在一些实施例中，所述酶切步骤中37°C孵育时间为14_18h。在一些实施例中，所述DNA清洗步骤中离心管快速离心13000g，30s。使分散的磁珠聚集成比较紧实的小球，有助于磁珠迅速被磁力架完全吸附，从而大大减少了磁珠的损失，提高了复孔样品管间的重复性，同时还缩短了清洗时间，提高工作效率；与常规方法相比，本专利技术方法能将DNA回收率提高50%以上的，即使是痕量DNA( < Ipg)，其回收率也能超过70%，并能稳定在70% -130%之间，符合相关法规要求。该方法适用于生物制品制备过程的中间体和原液中残留DNA的提取，可用于监测纯化工艺去除外源DNA的能力，满足原液残留DNA批检验的要求，为生物制品中残留DNA的提取提供了有效的方法。附图说明图1常规方法提取空白缓冲液(DDB)、BSA和单克隆抗体样品中的DNA回收率；图2比较不同酶切条件对DNA回收率的影响；图3比较不同DNA洗脱时间对DNA回收率的影响；图4常规方法与本专利技术方法所得回收率比较；图5不同纯化步骤单克隆抗体样品中DNA含量；图6三种抗体样品中残留DNA含量。具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。以下实施例涉及到的材料和试剂，具体如下试剂PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit+Prep SEQ Residual DNASamplePreparation Kit(AB, PN :4415413), resDNASEQ Quntitative CHODNA Kit(AB, PN 4402085)，95%乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，异丙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)材料DNA低吸附离心管和DNA低吸附枪头(购自Eppendorf)、PCR反应管(购自Bio-rad)仪器6孔磁力架(购自Ambion)、电热恒温水槽(购自上海一恒科技有限公司)，Real-time PCR 仪(Bio-Ra本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从重组蛋白制品中提取残留DNA的磁珠法，其包括样品制备、酶切、DNA结合、DNA清洗和DNA洗脱的步骤，其特征在于所述酶切步骤：蛋白酶K与重组蛋白制品中蛋白质的质量比率至少为1∶6，37℃孵育不少于10h；所述DNA洗脱步骤，70℃水浴不少于10min。
【技术特征摘要】
1.一种从重组蛋白制品中提取残留DNA的磁珠法，其包括样品制备、酶切、DNA结合、 DNA清洗和DNA洗脱的步骤，其特征在于所述酶切步骤蛋白酶K与重组蛋白制品中蛋白质的质量比率至少为1: 6，37°C孵育不少于IOh ;所述DNA洗脱步骤，70°C水浴不少于lOmin。2.如权利要求1所述的磁珠法，其特征在于所述重组蛋白制品为单克隆抗体、细胞因子、激素、生长因子、酶类、或凝血因子中之一。3.如权利要求1所述的磁珠法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱红枚，王少雄，王洪芳，吕品，
申请(专利权)人：嘉和生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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