本发明专利技术公开了一种磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的试剂盒及提取方法。本发明专利技术的磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的试剂盒，包括A液、B液、磁珠悬液、75%乙醇溶液和TE缓冲液，其中，A液含有2～4wt%CTAB，1～1.5mol/L氯化钠，18～22mmol/LEDTA，80～120mmol/LTris-HCL，10～30mg/mL蛋白酶K，1～3wt%β-巯基乙醇，pH=7.5～8.5；B液含有0.4～0.6wt%CTAB，0.03～0.05mol/L氯化钠，pH=7.5～8.5；磁珠悬液由磁珠和0.01～0.03wt%的NaN3水溶液按1：1.5～2.5的体积比组成。利用本发明专利技术试剂盒提取的基因组DNA回收率高、纯度高、片段完整、无PCR抑制物质。DNA提取过程可由仪器完成从裂解、纯化、收集产物的全过程，提取所使用的试剂高效安全，最大程度避免对人体的伤害。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种利用磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的试剂盒及其提取方法。
技术介绍
核酸的分子生物学技术是进行病原微生物检测，转基因检测，物种鉴定，物种起源、多样性评估及其亲缘关系、系统进化等常用研究手段之一。纯化的DNA是用来进行PCR检测最基本材料，尽管在不同样品(原材料、食品成分、加工产品)中，DNA是一个相对稳定的分子，但是对于深加工产品来说，DNA提取技术仍然是基于DNA扩增的检测技术的瓶颈，能否提取出高质量的DNA分子是判断随后采用的分析技术是否合理的关键，提取方法的灵敏度、特异性也将直接关系到后续试验的成败。对于一般的分析来说，好的制备技术应 该是简便、安全、廉价，并且能保证DNA质量和数量。用于检测分析的DNA应具备一定的浓度、纯度、完整性。材料和提取技术都可能对这些参数受到影响，反过来，这些参数也可能影响分析技术是否合理。传统的核酸分离方法主要有CTAB法、SDS法、PVP法和和硅胶吸附，提取的步骤主要包含细胞裂解、有机溶剂萃取、沉淀，高速离心等过程，裂解步骤中，蛋白质和多糖结合CTAB和/或PVP从溶解DNA的液相中分离出来，硅胶吸附也可用来协助DNA的提取和纯化，裂解后，用酚和/或氯仿去除液相中的有活性的核酸酶和PCR抑制因子，如亲脂类分子、多糖、蛋白质。DNA结合盐酸胍一氢氧化物离液剂中的硅胶颗粒而沉淀，沉淀用异丙醇洗涤。最后，沉淀用低浓度盐溶液溶解。相关试剂盒包括Wizard试剂盒(Promega Corp. , Madison,WI)、Dneasy (Qiagen, Crawley, UK)等。这些纯化方法的步骤繁杂、费时长、回收率低,且提取过程中使用酚、氯仿、异丙醇等有毒有害物质，影响人体健康。磁株分离纯化技术是一种简单有效的核酸提纯方法，主要在磁珠上连接能特异性吸附核酸的功能基团，在样本的裂解溶液中特异性地吸附目标核酸，随后通过磁分离技术将核酸从裂解溶液中提取出来。磁珠法能够很好地克服传统核酸方法的缺点，具简便、快捷、高效等特点，符合核酸自动化提取要求，因此，该方法已广泛应用于细菌、动物血液、唾液等组织的DNA的提取中，也相应出现了各种各样的试剂盒。但是，与动物细胞相比，植物细胞除了有细胞壁外，还含有大量的多糖、脂质、色素和酚类物质，利用现有的磁珠法提取DNA试剂盒对植物组织的基因组DNA进行提取，所得产物的回收率和纯度都比较低，尤其是对于深加工后的植物产品，由于其经过高温处理后，基因组DNA的断裂降解程度高，利用现有的磁珠法提取DNA试剂盒对其基因组DNA进行提取，产物回收率和纯度都极低，不能满足进一步实验的需求。
技术实现思路
针对现有技术所存在的不足，本专利技术的一个目的是提供一种磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的试剂盒。本专利技术的另一个目的是提供一种磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的方法。本专利技术所采用的技术方案是 一种磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的试剂盒，包括A液、B液、磁珠悬液、75%乙醇溶液和TE缓冲液，其中， A 液含有 2 4wt%CTAB, I 1. 5mol/L 氯化钠，18 22mmol/L EDTA，80 120 mmol/L Tris-HCL, 10 30 mg/mL 蛋白酶 K, I 3wt%i3 -疏基乙醇，pH =7. 5 8. 5 ; B 液含有 O. 4 O. 6 wt % CTAB, O. 03 O. 05 mol/L 氯化钠，pH =7. 5 8. 5 ; 磁珠悬液由磁珠和O. 01 O. 03wt%的NaN3水溶液按1:1. 5 2. 5的体积比组成。优选的，所述A 液含有 3 wt %CTAB,1. 4mol/L 氯化钠，20mmol/L EDTA，100 mmol/LTris-HCL, 20 mg/mL 蛋白酶 K, 2 wt %β-疏基乙醇，pH =8.0。优选的，所述B 液含有 O. 5 Wt %CTAB，O. 04mol/L 氯化钠，pH =8. O。优选的，所述磁珠的直径为3 7 μ m。一种粮食深加工产品基因组DNA的提取方法，包括如下步骤 1)将预处理后的粮食深加工产品加入到A液中，60 70°C温浴40 80min； 2)取上清液，加入B液和磁珠悬液，混合均匀； 3)将磁珠转移到75%的乙醇溶液中清洗； 4)清洗后的磁珠用TE缓冲液进行洗脱，得到纯化的DNA。样品与A液的质量体积比为Ig :4 6ml。上清液与B液的体积比为1:1 3。上清液与磁珠悬液的体积比为10 20 :1。所述粮食深加工产品包括米制品、饲料、食用油等。本专利技术的有益效果在于 I)利用本专利技术试剂盒提取的基因组DNA回收率高、纯度高、片段完整、无PCR抑制物质，使用本试剂提取Ig深加工产品米粉、饲料以及1000 mL花生油，分别纯化得到了约640μ g、520 μ g、和12 μ g的高纯度基因组DNA，纯度Α260/280 =1. 75-2. 06之间。2)本专利技术的DNA提取方法仅需4个步骤，分别是裂解、沉淀、清洗、洗脱，全自动操作，可以由仪器完成从裂解、纯化、收集产物的全过程，实验过程中完全无需人工干预和检测，且提取所使用的试剂高效安全，最大程度避免对人体的伤害。附图说明图1是不同方法提取米粉、饲料基因组DNA的实时荧光PCR检测结果图(1:本专利技术试剂盒提取米粉DNA，2:本专利技术试剂盒提取饲料DNA，3:商品试剂盒I提取米粉DNA，4 :商品试剂盒I提取饲料DNA，5 :商品试剂盒2提取米粉DNA，6 :商品试剂盒2提取饲料DNA，7 :商品试剂盒3提取米粉DNA，8 :商品试剂盒3提取饲料DNA)； 图2是花生油提取的基因组DNA荧光PCR扩增结果图。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1 磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的试剂盒，包括A液、B液、磁珠悬液、75%乙醇溶液和TE缓冲液，其中， A 液的组成为3wt%CTAB，1. 4mol/L 氯化钠，20mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCL, 20mg/mL蛋白酶K，2wt%i3-巯基乙醇，pH =8.0，溶剂为水； B液的组成为0. 5wt%CTAB,O. 04mol/L氯化钠，pH =8. 0，溶剂为水； TE缓冲液的组成为10mM Tris-HCl，ImM EDTA，pH=8. 0，溶剂为水； 磁珠缓冲液的组成为磁珠(直径是3 7 μ m) (OMEGA公司)与O. 02wt% NaN3水溶液按1:2的体积比混合。 利用上述试剂盒提取米粉或饲料基因组DNA，包括如下步骤1.取Ig粉碎过的米粉或饲料，加入到5ml A液中，65°C孵化60min。2.常温lOOOOrpm，离心lOmin，直至沉淀完全，吸取上清液备用。3.转移300 μ I上清液,加入到KingFisher mL 5联管第一、二孔,第一孔中加入600 μ I B液和20 μ I磁珠悬液；第二孔中加入600 μ I B液；第三和第四孔加900 μ I的75%乙醇溶液；第五孔加400 μ L TE缓冲液。4.将5联管放入全自动核酸提取仪Thermo S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的试剂盒，包括A液、B液、磁珠悬液、75%乙醇溶液和TE缓冲液，其中，A液含有2～4wt%CTAB，1～1.5mol/L氯化钠，18～22mmol/L?EDTA，80～120?mmol/L?Tris?HCL，10～30?mg/mL蛋白酶K，1～3wt%β?巯基乙醇，pH?=7.5～8.5；B液含有0.4～0.6?wt?%?CTAB，0.03～0.05?mol/L氯化钠，pH?=7.5～8.5；磁珠悬液由磁珠和0.01～0.03wt%的NaN3水溶液按1：1.5～2.5的体积比组成。
【技术特征摘要】
1.一种磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的试剂盒，包括A液、B液、磁珠悬液、75%乙醇溶液和TE缓冲液，其中， A 液含有 2 4wt%CTAB, I 1. 5mol/L 氯化钠，18 22mmol/L EDTA，80 120 mmol/L Tris-HCL, 10 30 mg/mL 蛋白酶 K, I 3wt%i3 -疏基乙醇，pH =7. 5 8. 5 ;B 液含有 O. 4 O. 6 wt % CTAB, O. 03 O. 05 mol/L 氯化钠，pH =7. 5 8. 5 ; 磁珠悬液由磁珠和O. 01 O. 03wt%的NaN3水溶液按1:1. 5 2. 5的体积比组成。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述A液含有3wt%CTAB，1.4mol/L氯化钠，20mmol/L EDTA, 100 mmol/L Tris-HCL, 20mg/mL 蛋白酶 K, 2 wt %β-疏基乙醇，pH=8. O03.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：张卫东，廖力，王岚，梁玉英，徐淼锋，迟远丽，
申请(专利权)人：张卫东，
类型：发明
国别省市：
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