减少了宿主糖含量的乙型肝炎病毒表面蛋白制造技术

为了生产含有大大降低了获取糖含量的颗粒形式的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面蛋白，在缺乏蛋白质糖基化能力的重组酵母宿主中表面编码ＨＢＶ表面蛋白的ＤＮＡ。这些ＨＢＶ表面蛋白显示出由ＨＢＶ病毒体包膜蛋白开放阅读架的Ｓ区进行遗传编码的抗原性位点，并且与由野生型酵母细胞产生的ＨＢ↓［ｓ］Ａ↓［ｇ］颗粒相比，所说ＨＢＶ表面蛋白含有大幅减少了的获得糖分。这些颗粒可用作疫苗对由ＨＢＶ或与ＨＢＶ血清学相关的其它因子引起的疾病和／或感染进行主动和被动性治疗或预防。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
乙型肝炎病毒(HBV)是引起多种人类肝脏疾患的感染性因子。许多感染了HBV的患者都经历疾病的急性期，继而进入恢复期。但是，部分患者没能消除所受到的感染，因而成为HBV感染的慢性携带者。HBV感染在世界许多地区呈现出流行性，感染的高发生率见于产期，由受慢性感染的母亲传染给其新生儿，而新生儿常常又维持其慢性感染。据估计，世界范围内受HBV感染的人数已逾3亿。在这些携带者中，每年有成千上万的患者死于长期患慢性乙型肝炎所致的并发症(肝硬化和/或肝癌)。与HBV共同感染的乙型肝炎delta病毒能引起通常是致死性的急性暴发性疾病。delta病毒不能由其自身的遗传物质编码作为病毒体包膜的蛋白质;而是被由共同感染的HBV编码的包膜蛋白所包裹，因此，该病毒与下文述及的HBV蛋白共有一种密切的结构和免疫关系。目前还不清楚其它的感染性因子是否与HBV也具有类似的关系。然而，已经清楚，借助于一类与HBV有微弱或部分抗原交叉反应活性的因子，被扩展了血清学反应性范围或被增强了免疫原效力的蛋白质可用于疾病(或感染)的诊断或预防(或治疗)系统中。乙型肝炎病毒体由二类结构蛋白组成核心蛋白和包膜或表面蛋白。除了作为主要的表面蛋白或病毒体，即Dane颗粒外，包膜蛋白也是澳大利亚抗原，或22nm颗粒的主要成分。这些包膜蛋白是编码至少389个氨基酸(aa)的大的病毒开放阅读框架(ORF)的翻译产物。该ORF分成三个区，每区以可在体内作为翻译起点的ATG密码子起始。这些区域在基因中以5′-3′方向分别称作前S1(108aa)、前S2(55aa)和S(226aa)。因此，这些区域定义了被称为S或HBsAg(226aa)、前S2+S(281aa)和前S1+前S2+S(389aa)的三种多肽，这三种多肽也分别称为p24/gp27、p30/gp33/gp36和p39/gp42(以及主要、中等和大蛋白)。HBV的包膜蛋白是含有碳水化合物侧链(聚糖)的糖蛋白，该侧链以N-配糖键与被定义的肽识别位点相连接。因此，在自然感染过程中产生的HBV多肽所包含的种类有p24/gp27(S多肽及其糖基化衍生物)、p30/gp33/gp36(仅在前S2区糖基化的前S2+S多肽和在S及前S2区糖基化的前S2+S多肽)和p39/gp42(前S1+前S2+S肽及其在前S1区糖基化的衍生物)。现行可用的从血浆中获得的疫苗由只含有S区(包括p24单体和其糖基化衍生物)的蛋白质组成，而目前成功地制备出的酵母源性疫苗由S多肽(仅含非糖基化p24类多肽)独自构成。22nm HBsAg颗粒已从慢性携带者血浆中纯化出来。由于他们的血浆呈病毒颗粒阳性，这些慢性携带者被称为HB+S。如果感染者已产生了足够的免疫反应，他们能清除感染，变成HB-S。如果产生了抗HBS的抗体，这些感染者被称为抗-HBs+。由此说来，抗-HBs+与疾病的恢复和对疾病再感染的免疫力，及对HBV再感染的免疫力相关。因此，可望证实通过HB疫苗刺激或形成的抗-HBS对HBV感染具有保护作用。上述假设已进行了实验性检验。在人类之外，黑猩猩是少数几种对HBV感染完全易感的物种之一，这种感染以可定量的标志物如HB+S和血清中肝酶水平的升高来反映。用三种剂量的纯化HBsAg颗粒接种黑猩猩，然后用感染性HBV静脉内注射加强。尽管接种动物模型表现出急性HBV感染征象，但HBsAg接种的动物则在这种感染中完全得到保护。因而，在这一实验系统中，由p24(或p24和p27)组成的HBsAg颗粒已足以诱导保护性免疫。受到这些观察结果的鼓舞，数家制造商已生产出由HBsAg颗粒组成的HB疫苗。为了扩大可用的HB疫苗的来源，制造商已转向用重组DNA技术介导病毒包膜蛋白的表达。在微生物系统中，大肠杆菌和啤酒酵母最常用于表达多种由重组得到的蛋白。许多试图在大肠杆菌中表达有免疫活性的HBsAg颗粒的尝试都未获成功。然而，啤酒酵母在表达有免疫活性HBsAg颗粒方面显示出了很大的多样性。这些颗粒(仅含有p24)在配制成疫苗时被证明能够完全防止黑猩猩遭受多种血清型的活HBV的侵袭。而且，在人类临床试验中，酵母源性S颗粒与血浆源性HBsAg同样具有免疫活性和有效地防止疾病或感染。因此，可确立用啤酒酵母作为控制重组HBsAg合成的宿主种属。此外，在酵母中表达用于人类的治疗因子和疫苗对于增加产量非常有益，因为酵母不含内毒素，对人无致病原性，能进行工业规模的发酵，并且没有因应用连续性哺乳动物细胞系(许多由病毒转化的细胞系对小鼠具致肿瘤原性，并且所有细胞系都含有原癌基因)所产生的多种安全性考虑。啤酒酵母(面包酵母)是能合成糖蛋白的真核细胞。酵母中的糖基化作用已成为许多近期综述文献中的话题。所说糖基化作用或聚糖向多肽上合适受体氨基酸(aa)的加成作用发生于特异的丝氨酸(ser)或苏氨酸(Thr)残基(O-连接)，或者发生于特定的天冬酰胺残基(N-连接)。于Ser或Thr残基部位进行O-连接加成作用的特异性还未清楚地认识，对特异性的确定是基于不同情况凭经验进行。进行N-连接糖基化作用的信号序列已清楚地定义为氨基酸序列Asn-X-Thr或Asn-X-Ser(其中的X代表任何氨基酸)。除了合成多种自体天然的糖基化蛋白，酵母还能够糖基化经重组技术表达的异种或外源蛋白质(如果异种蛋白含有进行N连接或O连接糖基化作用的合适糖基化信号序列)。在自然感染过程中产生的前S2+S多肽含有的“核心”(估计大小为3KD)N连接聚糖不超过2个，一个在S区，另一个在前S2区氨基酸残基4的Asn上。在Recombivax HB 或在酵母中合成的重组前S2+S的S区中的识别位点未被糖基化，但前S2区中的氨基酸残基4位点可被酵母识别和糖基化。前S1区在氨基酸残基4上具有一个N连接糖基化作用位点，在氨基酸残基26上有一个用于血清型adw的潜在的位点。本领域的专业技术人员很容易意识到前面对于前体S2糖基化作用的讨论也适用于前S2区以及前S1和S区中的各种不同序列。酵母合成的重组前S2+S中增加了一个“核心”聚糖，它与病毒感染过程中天然多肽所增加的“核心”聚糖相似。然而，如果用以进行糖基化作用的酵母宿主细胞是“野生型”(即含有天然糖基化作用所需要酶的全部互补成份，实际上对于所有常用的酵母菌株都是这种情况)，即可以与酵母制造其自身结构甘露蛋白一致的方式，用大量额外甘露糖残基来延伸大量的这种聚糖，当这种聚糖的延伸加成作用发生于外来基因产物，如前S2+S多肽时，它被称为超糖基化作用(hyperglycosylation)。本领域技术人员很容易认识到有关酵母的讨论也将扩展到可能具有不同糖基化作用方式的其它宿主细胞(例如昆虫、真菌等)。进一步还表明，在野生型酵母宿主细胞中表达的HBV表面蛋白22nm颗粒的重组形式在22nm颗粒中获取了一定量的酵母细胞糖类(至少部分衍生于酵母宿主细胞的结构甘露蛋白和甘露肽)。这种获取的糖类会引起潜在性问题，包括它可能刺激抗糖基化蛋白上酵母糖类基团的抗体产生，含有所获酵母糖类的疫苗免疫原将与存在于大多数哺乳动物中的抗酵母抗体反应，因而减弱了其作为免疫原和疫苗的效力。借助下述任何方法，可以消除超糖基化作用以及对完整甘露蛋白和甘露肽的获取，并且使糖基化作用局限于HBV前体S和S多肽以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生产重组多肽和蛋白质的真核表达系统，其生产的重组多肽和蛋白质所含的宿主细胞糖或糖蛋白含量大大降低。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：PJ尼斯肯，A哈戈皮安，
申请(专利权)人：麦克公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]