抗蛋白酶解的抗体制剂制造技术

具有基本上均一和未唾液酸化的糖形如G0和G2的抗体制剂，通过酶促处理，在某些条件下进行的表达，特定宿主细胞的使用和用血清进行的接触来制备。这些抗体制剂能抵抗蛋白酶切割，所述蛋白酶例如木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、基质金属蛋白酶如MMP-7、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、溶基质蛋白酶(MMP-3)、巨噬细胞弹性蛋白酶(MMP-12)和糖基化修饰酶。具有基本上均一和未唾液酸化的糖形的抗体制剂及测试抗体中的糖基化情况的方法，可用于鉴定抗体特性和/或用于治疗以蛋白酶活性提高为特征的疾病或病症。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及评估抗体的糖形含量，更具体的说涉及制备和使用基本上均一的糖形(homogeneous glyc oform),例如非唾液酸化糖形的抗体制剂的方法。
技术介绍
抗体是可溶性血清糖蛋白，在先天免疫中起到重要的作用。所有天然产生的抗体其重链恒定区中的保守位置处的糖结构随同种型的不同而不同(图I)。每种同种型各有独特的一套N-连接寡糖结构,该结构对蛋白质装配、分泌或功能活性有不同影响(Wright,A.和 Morrison，S. L ,Trends Biotech. 15 :26-32 (1997))。附接的 N-连接寡糖的结构(图2)因加工程度的不同相差甚大，可包括高甘露糖以及具有或不具有等分GIcNAc和核心岩藻糖残基的复杂二天线型寡糖(Wright, A.和Morrison, S. L.同上)。通常，附接在特定糖基化位点的核心寡糖结构会发生不均一加工，使得甚至单克隆抗体也以多种糖形存在。同样，已证实各种产抗体细胞系之间在抗体糖基化方面差别显著，而在不同培养条件下生长的特定细胞系中观察到的差别不显著。在各种抗体同种型(例如IgE、IgD、IgA、IgM和IgG)中，IgG最为丰富,其中IgGl亚类显示最显著程度和类别的效应子功能。IgGl类型的抗体在通常认为其中ADCC和⑶C活性重要的癌症免疫疗法中是最常用的抗体。在结构上，IgG铰链区和CH2结构域在抗体效应子功能中起到主要作用。Fe区中存在的N-连接寡糖(通过铰链、CH2和CH3结构域的二聚化形成)会影响效应子功能。这些共价结合的寡糖是复杂的二天线型结构，且高度不均一(heterogeneous)(参见图 2) ；NANA>5-N-乙酸神经氨酸(NeuAc)或 NGNA、5_N_ 轻乙酸神经氨酸(NeuGc)是通常的“唾液酸”。其它唾液酸已被发现或可化学合成。每个CH2结构域中Asn297处为保守N-连接糖基化位点。在成熟抗体中，附接到Asn297的两个复杂二天线型寡糖隐藏在CH2结构域之间，与多肽骨架形成广泛的接触。已发现它们的存在对于抗体介导效应子功能如 ADCC 是必要的(Lifely，M. R.等，Glycobiology 5:813-822(1995)；Jefferis, R.等，Immunol Rev. 163 :59-76 (1998) ;Wright, Α·和 Morrison, S. L.同上)。已开始研究特定位置处的各个糖类的生物学存在和意义。例如，抗体糖基化的程度受年龄、性别和疾病的影响(Raju, T.S.等，Glycobiology 2000. 10(5) :477-86)。一般来说，寡糖结构有一定的物种特异性，因此相差甚大。此外，还研究了具有和不具有等分GlcNAc和核心岩藻糖残基的寡糖结构的生物学意义。人IgG和许多重组产生的IgG含有少量的唾液酸化(或者未唾液酸化(unsialylated)或无唾液酸化(asialyated))寡糖,但是，大多数IgG含有非唾液酸化(non-sialylated)寡糖结构。抗体的蛋白酶解切割通常在生理条件下发生，这也可以是基于抗体结构的生物治疗药物的生产中的一个工业加工步骤。木瓜蛋白酶产生或加工的治疗性抗体片段Fab正得到更为广泛的使用。尽管木瓜蛋白酶是植物来源的酶，但在IgGl铰链中鉴定出多个蛋白酶切割位点，总结于图3。 可用不同的蛋白水解酶将重组I gG转变成I gG片段，如Fab和F (ab ’)2及Fe (图I和图3)。各消化片段代表了可用于控制和治疗人类疾病的主要生物治疗药物类别。阿昔单抗(abciXimab，c7E3 Fab,以商标REOPRO 市售)是Fab治疗药物的一个实例。该47，615道尔顿Fab片段从细胞培养上清液纯化并经木瓜蛋白酶消化和柱层析得到。其它实例包括=DigiFab(DigiTAB)，从绵羊多克隆抗体制得的Fab片段制剂，用于地高辛中毒的潜在治疗；CroFAb，从免疫了蛇毒液的绵羊获得的单价Fab片段制剂，作为抵御四种最常见北美响尾蛇咬伤的抗蛇毒素，美国2000年10月批准；和EchiTAb，基于单特异性绵羊多克隆抗体的Fab片段的抗蛇毒素,用于治疗西非常见的地毪毒蛇(carpet viper,Echis Ocellatus)的咬伤。其它开发中的 Fab 包括ranibizumab (rhuFab V2 ；AMD-Fab ;Lucentis), Genentech的贝伐单抗的高亲和力Fab变体，作为年龄相关性黄斑变性的潜在治疗药物；和5G1. 1，为能防止人补体成分C5被切割成其促炎成分的静脉用人源化单克隆抗体，作为几种慢性炎性疾病，包括类风湿性关节炎(RA)、膜性和狼疮性肾炎、皮肌炎和阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的潜在治疗药物。其它具有潜在治疗用途的含Fab组合物包括化学修饰Fab如⑶P-870，它是连接到聚乙二醇(PEG)的人源化抗TNF a -Fab片段。CDP-870衍自小鼠抗人TNF α抗体，该抗体因其高亲和力结合和中和潜力而被选择。这个抗体的Fab片段通过重组DNA技术构建、人源化并在大肠杆菌中通过补料-分批发酵合成。这个发酵程序的产率达到300至1200mg蛋白质/升细菌培养物。为提高血浆半寿期，将PEG部分加到Fab片段。出于这个目的，开发了位点特异性缀合方法，其中将单个半胱氨酸残基引入到Fab片段的铰链区中，以便为了提高其循环半寿期的目的共价加入亲水性聚合物(PEG)。比起在哺乳动物细胞培养物中常规生产的抗体，使用低成本的大肠杆菌技术来生产Fab片段，让生产商(Celltech)降低OTP-870的制造成本10至20倍。大肠杆菌不表达糖基化蛋白质。至今为止还没有探明聚糖存在和组成与IgG对人类或其它物种中的蛋白酶解切割的易感性之间的关系。因此，需要认识治疗相关抗体结构的蛋白酶解模式与聚糖结构之间的关系，目的是为了有效生产抗体，并作为鉴定抗体聚糖的存在和/或组成的工具。专利技术概述本专利技术包括提高抗体制剂抵抗蛋白酶切割的能力的方法，和使用这种抗体制剂治疗与高水平的蛋白酶的存在有关的病理状况如癌症的方法。在本专利技术方法的一个实施方案中，抗体制剂在抗体的Fe区中基本上不含唾液酸化糖形。在本专利技术的另一个方面，蛋白酶选自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、包括MMP-7在内的基质金属蛋白酶、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、溶基质蛋白酶(MMP-3)、巨噬细胞弹性蛋白酶(MMP-12)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和包括糖基化修饰酶如唾液酸酶-A、半乳糖苷酶等在内的其它蛋白酶。在一个实施方案中，将抗体制剂进行修饰，以使在糖形GO方面基本上是均一的。在另一个实施方案中，本专利技术包括提高或降低抗体制剂抵抗蛋白酶切割的能力的方法，和将这种抗体制剂用于与升高或减低水平的蛋白酶的存在有关的疾病或病症的方法。本专利技术还包括通过用唾液酸酶体外处理抗体制剂，并任选用β -半乳糖苷酶和/或α -半乳糖苷酶进一步处理抗体以除去半乳糖残基，来提高抗体对蛋白酶的稳定性的方法，所述蛋白酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、包括ΜΜΡ-7在内的基质金属蛋白酶、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、溶基质蛋白酶(ΜΜΡ-3)、巨噬细胞弹性蛋白酶(ΜΜΡ-12)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：T·S·拉于，B·斯卡伦，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：