蛋白酶调节的抗体制造技术

本公开提供了蛋白酶调节的抗体，其特异性结合组织因子途径抑制剂（TFPI）。所述抗体可用于治疗出血性疾病，例如血友病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白酶调节的抗体本申请要求2012年3月30日提交的系列号61/617,837的权益，其通过引用以其整体并入本文。本公开引用的所有文件通过引用以其整体并入本文。本申请通过引用并入2012年3月26日建立并命名为“0297301274sequencelisting.txt”的64kb文本文件，其为本申请的序列表。

是血友病和其它凝血病的治疗。附图说明图1.蛋白酶调节的抗体的实施方案的图解说明。VH，重链可变区；VL，轻链可变区；CH，重链恒定区；CL，轻链恒定区。图2.有和没有凝血酶消化的两个蛋白酶调节的抗TFPIFab片段（“Fab-1”和“Fab-2”）的蛋白印迹。图3.图形显示通过ELISA测定的有和没有凝血酶消化的Fab-1和Fab-2的组织因子途径抑制剂（TFPI）结合。图4.图形显示有和没有凝血酶消化的Fab-1（Fab1）和Fab-2（Fab2）的TFPI结合的BIACORETM测量。图5.在HEK2936E细胞中表达的纯化的IgG抗体的SDS-PAGE。图6.亲本IgG（“亲本IgG”；顶部）和IgG2-接头1（底部）的蛋白印迹。泳道1，用凝血酶（1单位）消化；泳道2，无蛋白酶（对照）；泳道3，用牛纤溶酶消化；泳道4，用肠激酶（0.02µg）消化；泳道5，用牛因子Xa（1µg）消化；泳道6，用蛋白裂解酶（matriptase，MTSP）（0.5µg）消化；泳道7，用尿激酶（uPA）（0.25µg）消化；泳道8，用人鼻病毒3C蛋白酶（HRV3C）（2单位）消化。图7.图形显示通过ELISA测定的有和没有凝血酶消化的IgG的TFPI结合。图8.图形显示有和没有凝血酶消化的亲本IgG和IgG-接头1的TFPI结合的BIACORETM测量。图9.蛋白印迹，显示用人蛋白酶的IgG-接头1和WT抗体的蛋白酶消化。专利技术详述本公开提供了蛋白酶调节的抗体，其特异性结合组织因子途径抑制剂（TFPI）。所述抗体可用于治疗出血性疾病，例如血友病。在一些实施方案中，蛋白酶调节的抗TFPI抗体可以被凝血酶和/或纤溶酶切割。通过初始抑制TFPI，这些蛋白酶调节的抗TFPI抗体促进凝血酶和/或纤溶酶的生成，其依次切割抗体并去除或显著降低它们对TFPI的结合活性。此负反馈允许所述抗体促进在安全的治疗窗口内的凝血。1.蛋白酶调节的抗TFPI抗体本文公开的蛋白酶调节的抗体特异性结合TFPI，即，它们结合TFPI的亲和力高于（例如，至少两倍高于）它们对于不相关抗原（例如BSA，酪蛋白）的结合亲和力。如本文所用术语“组织因子途径抑制剂”或“TFPI”指细胞天然表达的人TFPI的任何变体、同种型和物种同源物。在一些实施方案中，蛋白酶调节的抗体结合TFPI，具有至少约105M-1至约1012M-1的亲和力(例如105M-1、105.5M-1、106M-1、106.5M-1、107M-1、107.5M-1、108M-1、108.5M-1、109M-1、109.5M-1、1010M-1、1010.5M-1、1011M-1、1011.5M-1、1012M-1)。抗体结合抗原的亲和力(Kd)可以使用任何本领域已知的方法测定，例如免疫测定诸如酶联免疫特异性测定（ELISA）、生物分子相互作用分析（BIA）(例如，Sjolander&Urbaniczky;Anal.Chem.63:2338-2345,1991;Szabo,等,Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705,1995)，和用于对表达抗原的细胞上结合的抗体定量的荧光激活细胞分选(FACS)。BIA是用于实时分析生物特异性相互作用，而不标记任何相互作用物的技术（例如BIACORETM）。光学现象表面等离子体共振（SPR）中的变化可以用作生物分子之间的实时反应的指示。蛋白酶调节的抗TFPI抗体可以使用基本上全长的免疫球蛋白分子（例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgE、IgA），其抗原结合片段，例如Fab或F(ab′)2或包含抗原结合位点能够特异性结合TFPI的构建体，例如scFv、Fv或二体（diabody）进行构建。术语“抗体”还包括其它蛋白支架，所述其它蛋白支架能够容纳抗体互补决定区（CDR）插入与天然抗体中发现的相同活性结合构象，使得对这些嵌合蛋白观察到的对TFPI的结合相对于所述CDR衍生自的天然抗体的TFPI结合活性得以保留。如本文所用“分离的抗体”是基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体（例如，结合TFPI的分离的抗体基本上不含结合TFPI之外的抗原的抗体）。但是，结合人TFPI的表位、同种型或变体的分离的抗体可以具有对其它相关抗原的的交叉反应性，例如来自其它物种的抗原（例如，TFPI物种同源物）。分离的抗体可以基本上不含其它细胞材料和/或化学品。本文公开的蛋白酶调节的抗体被工程改造以包含被一种或多种蛋白酶识别的蛋白酶切割位点。如本文所用，“蛋白酶切割位点”指被蛋白酶识别并切割的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述蛋白酶切割位点位于其可变和恒定区之间的位置。在一些实施方案中，所述蛋白酶调节的抗TFPI抗体包括可以被凝血酶、纤溶酶和/或因子Xa切割的一个或多个蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，蛋白酶调节的抗TFPI抗体的可变和恒定区之间的氨基酸序列除了蛋白酶切割位点之外还包含多肽接头（如例如图1中图解说明）。所述接头可以是单个氨基酸或多肽序列（例如，至多100个氨基酸）。例如所述接头可以是GGGGS（SEQIDNO：149）。其它可用的接头包括SEQIDNO：151-176中所示的那些。在其它实施方案中，不存在接头，并且切割位点本身插入在可变和恒定区之间。已经确定了至少两个最优的凝血酶切割位点：(1)X1-X2-P-R-X3-X4(SEQIDNO:147)，其中X1和X2是疏水氨基酸，并且X3和X4是非酸性氨基酸，和(2)GRG。凝血酶特异性在精氨酸残基后切割。纤溶酶也可以切割上述两个切割位点，但是相比凝血酶具有较低的特异性。其它可用的凝血酶切割位点提供为SEQIDNO：1-60。其它可用的纤溶酶切割位点提供为SEQIDNO：12、47、48、53和61-130。在一些实施方案中，所述切割位点是LVPRGS(SEQIDNO:137)。在一些实施方案中，使用因子Xa切割位点，例如I-(E或D)-G-R(SEQIDNO:148)。其它可用的因子Xa切割位点提供为SEQIDNO：29、59和61-69。其它凝血酶和FXa切割位点或序列可以见于先前的发表，作者为Bianchini[BianchiniEP等2002JBC]。一种蛋白酶调节的抗体可以包括超过一种蛋白酶切割位点。除了切割位点，还可以将一个第二蛋白酶结合位点称为外位点（exosite）导入蛋白酶调节的TFPI抗体以使切割更加有效。凝血酶的外位点可以来自蛋白酶底物或抑制剂例如PAR1、纤维蛋白原和水蛭素的天然外位点。所述外位点还可以是天然外位点的衍生物。蛋白酶调节的TFPI抗体可以合成或重组产生。可利用一些技术产生抗体。例如，可使用噬菌体-抗体技术生成抗体(Knappik等,J.Mol.Biol.296:57-86,2000)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛋白酶调节的抗体，其特异性结合组织因子途径抑制剂（TFPI），包含可变结构域、恒定结构域和将可变结构域连接到恒定结构域的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含蛋白酶切割位点。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.30 US 61/6178371.蛋白酶调节的抗体，其特异性结合组织因子途径抑制剂（TFPI），包含可变结构域、恒定结构域和将可变结构域连接到恒定结构域的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含蛋白酶切割位点，所述蛋白酶调节的抗体包含选自下列的氨基酸序列：(1)SEQIDNO:131所示的Fab-1轻链和SEQIDNO:133的氨基酸1-239所示的Fab-1重链；(2)SEQIDNO:135所示的Fab-2轻链和SEQIDNO:136的氨基酸1-229所示的Fab-2重链；(3)SEQIDNO:139所示的IgG2-接头1轻链氨基酸序列和SEQIDNO:140所示的IgG2-接头1重链氨基酸序列；或(4)SEQIDNO:143所示的IgG2-接头2轻链氨基酸序列和SEQIDNO:144所示的IgG2-接头2重链氨基酸序列。2.权利要求1的蛋白酶调节的抗体，其中所述蛋白酶切割位点是凝血酶切割位点。3.权利要求1的蛋白酶调节的抗体，其中所述蛋白酶切割位点是纤溶酶切割位点。4.权利要求1的蛋白酶调节的抗体，其中所述蛋白酶切割位点是因子Xa切割位点。5.权利要求1-4任一项的蛋白酶调节的抗体，其中所述氨基酸序列进一步包含氨基酸接头。6.权利要求1-4任一项的蛋白酶调节的抗体，其是全长抗体。7.权利要求1-4任一项的蛋白酶调节的抗体，其是抗体片段。8.药物组合物，其包含权利要求1-7任一项的蛋白酶调节的抗体和药学可接受的媒介物。9.分离的核酸分子，其编码根据权利要求1-7任一项的蛋白酶调节的抗体。10.权利要求1-7任一项的蛋白酶调节的抗体在制备用于治疗凝血功能障碍的药物中的用途。11.权利要求10的用途，其中所述凝血功...

【专利技术属性】
技术研发人员：王卓智，R温特，J墨菲，
申请(专利权)人：拜尔健康护理有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US