本发明专利技术提供一株产胶原蛋白酶的菌株，该菌株产生的发酵液可以在温和的条件下将铬革屑完全水解。本发明专利技术提供的产胶原蛋白酶的菌株具体为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已于2015年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.11218。本发明专利技术菌株的发酵液中胶原蛋白酶活力达到518.01U/mL，在37℃条件下发酵液24h内能够有效水解铬革屑，处理后水解液中游离铬含量为处理前铬屑中铬含量的30-40％，发酵液对铬离子的耐受度为0.8mg/mL，可用于工业含铬革屑废弃物的处理。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于工业微生物应用领域，具体涉及一株产胶原蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌及其水解铬革屑的应用。
技术介绍
制革工业每年要产生大量的固体废弃物，这些固体废弃物主要由生物质-皮胶原构成，是原皮修边角料、灰皮片削皮屑等不含铬胶原和蓝皮削匀、修边等产生的含铬胶原废弃物。不含铬废弃物中主要被用于生产动物蛋白纤维、畜禽蛋白质饲料、人造肠衣和多肽物质等。含铬废弃物是胶原蛋白和Cr3+的复合物，不易被降解，既浪费资源，又会污染环境。传统的碱水解或酸水解工艺，由于铬分离困难、操作成本高、二次污染、水解产物的质量和应用等方面的原因，难于被广泛采用。以酶为基础的制革生物技术在清洁性、环境友好性方面独具特色，这些技术在制革工业的广泛应用，是解决制革工业严重污染，促进制革工业持续发展的重要途径；因此，铬屑的酶解及水解物的综合利用是有望解决铬屑污染，实现再生资源化的有效途径。本专利技术从天津富盛皮革制品有限公司长期堆积废铬屑的土壤中，筛选到一株可以水解含铬废弃物的菌株，为制革工业含铬废弃物的清洁、环保处理途径的开发奠定基础。
技术实现思路
本专利技术提供一株产胶原蛋白酶的菌株，该菌株产生的发酵液可以在温和的条件下将铬革屑完全水解。本专利技术提供的产胶原蛋白酶的菌株具体为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，已于2015年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.11218，分类命名：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。本专利技术所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株通过以下方法分离、筛选得到：(1)称取土样2g，用18mL生理盐水浸泡摇匀后，取1mL加入到装有50mL/250mL富集培养基的三角瓶中，120～180r/min，33～37℃摇瓶培养1～2d；其中所述富集培养基：明胶10g/L，葡萄糖5g/L，NaCl5g/L，pH7.2～7.5。；(2)初筛：将步骤(1)制备的富集培养液梯度稀释后涂布于初筛平板上，37℃培养箱中培养大约24h。观察菌落生长情况，选取具有透明圈的菌落，转接到初筛平板，编号记录。挑选明胶水解圈与菌落直径较大的菌株进行复筛；其中所述初筛培养基：明胶50g/L，NaCl0.1g/L，葡萄糖50g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，pH7.2～7.5；(3)复筛：挑取步骤(2)中透明圈直径比菌落直径较大的菌落，接到50mL/250mL种子培养基中，摇瓶培养8～12h，再按照2％～5％的接种量接种到50mL/250mL的复筛培养基中，150～200r/min，摇瓶培养24～48h。8000r/min，5min离心后取上清液，测定胶原蛋白酶活力；其中所述种子培养基：牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，pH自然；复筛培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉1.5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaH2PO4·2H2O0.5g/L，CaC120.05g/L，K2HPO4·3H2O2.5g/L，pH为7.0～7.5；(4)8000r/min离心步骤(3)得到的发酵液5min，取上清进行胶原蛋白酶活力的测定，筛选出一株胶原蛋白酶活力较高的菌株；(5)16SrDNA基因序列测定和分析。测序得到16SrDNA序列长度为1415bp，将该基因序列登陆Genbank，通过BLAST程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，BLAST结果表明其与芽孢杆菌属的多个解淀粉芽孢杆菌达到99％以上的同源性。经BLAST同源序列比较后，随机抽取其中的若干个序列构建系统进化树，结果见图4。(6)经Biolog微生物自动分析系统，并且结合16SrDNA基因序列分析，鉴定本专利技术的菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。本专利技术菌株的发酵液中胶原蛋白酶活力达到518.01U/mL，在37℃条件下发酵液24h内能够有效水解铬革屑，处理后水解液中游离铬含量为处理前铬屑中铬含量的30-40％，发酵液对铬离子的耐受度为0.8mg/mL，可用于工业含铬革屑废弃物的处理。本专利技术的解淀粉芽孢菌株具有营养要求简单、生长迅速、安全无毒等优点。研究表明，利用解淀粉芽孢杆菌发酵产生的酶液可以将铬革屑水解的特点，将其应用铬革屑的水解处理，在环境保护和资源重复利用方面具有广阔的应用前景。附图说明图1：本专利技术菌株菌落形态图；图2：本专利技术菌株个体形态图；图3：本专利技术菌株发酵液水解铬革屑前后效果对比图，其中，3a为发酵水解前，3b为发酵水解24h后；图4：本专利技术菌株系统进化树；图5：铬离子含量标准曲线；图6：胶原蛋白酶铬离子耐受曲线。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本专利技术所用培养基如下：富集培养基：明胶10g/L，葡萄糖5g/L，NaCl5g/L，pH7.2～7.5；初筛培养基：明胶50g/L，NaCl0.1g/L，葡萄糖50g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，pH7.2～7.5；种子培养基：牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，pH自然；复筛培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉1.5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaH2PO4·2H2O0.5g/L，CaC12。实施例1：菌株的筛选、分离、鉴定(1)菌株的筛选和分离：本专利技术筛选菌株所用土样采集自天津富盛皮革制品有限公司长期堆积废皮屑的土壤中。①富集培养：称取土样2g，用生理盐水18mL浸泡摇匀后，取1mL加入到装有50mL/250mL富集培养基的三角瓶中，150～200r/min，33～37℃摇瓶培养1～2d。②初筛：将步骤①制备的富集培养液梯度稀释后涂布于初筛平板上，37℃培养箱中约24h。观察菌落生长情况，选取具有透明圈的菌落，转接到初筛平板，编号记录，挑选明胶水解圈与菌落直径较大的菌株进本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株产胶原蛋白酶的菌株，其特征在于，所述菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏编号为：CGMCC No.11218。
【技术特征摘要】
1.一株产胶原蛋白酶的菌株，其特征在于，所述菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus
amyloliquefaciens)，保藏编号为：CGMCCNo.11218。
2.利用权利要求1所述菌株产胶原蛋白酶的方法，其特征在于，所述菌株的发酵培养基为：
葡萄糖20g/L，酵母粉1.5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaH2PO4·2H2O0.5g/L，CaC120.05g/L，
K2HPO4·3H2O2.5g\...
【专利技术属性】
技术研发人员：李玉，薛斌，王洪彬，路福平，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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