一种酶解蛋白质的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶解蛋白质的方法，将蛋白质加水搅拌均匀，放入电泳槽，在80-120V电压下电泳，电泳结束后收集蛋白质溶液，使用含有三氟乙醇的酶解缓冲溶液溶解蛋白质，之后对蛋白质进行还原和烷基化处理，将处理后的蛋白质溶液调节pH至7.5-8.5，然后加入占整个溶液体积90％-98％的胰蛋白酶，酶解，得到多肽产物；其中，电泳槽中的工作电极为氧化还原酶和锌铝层状双氢氧化物修饰的电极。本发明专利技术得到适合液相色谱-串联质谱分析肽段所用的酶解方法，为蛋白质组学分析提供稳定可靠的样品制备技术。

【技术实现步骤摘要】
一种酶解蛋白质的方法
本专利技术涉及蛋白质酶解领域，更具体地说，本专利技术涉及一种稳定快速酶解蛋白质的方法。
技术介绍
蛋白质是生物体内关键的结构和功能分子，是生命活动的执行者和生命现象的体现者。蛋白质组是指一种细胞或一种组织内的基因在特定条件下表达的所有蛋白质，对于这些蛋白质的分析和鉴定研究称为蛋白质组学。蛋白质是基因功能的执行者，其表达模式和功能分析已成为后基因组时代研究的核心内容之一。蛋白质组研究重点是针对一类细胞系、一种器官或一个生物体内的所有蛋白质，致力于阐明所有蛋白质种类信息和相互作用关系。通过蛋白质组学研究，可以寻找高灵敏度的生物标记物，鉴定出与疾病发生相关的新蛋白质靶点，通过蛋白质相互作用研究，阐明和解释生命活动的分子机理。生物体内蛋白质种类复杂，导致蛋白质分离分析存在诸多困难，因此，发展高通量、高灵敏度、高精确度的多肽分析技术是蛋白质组学研究中面临的主要挑战。用于蛋白质鉴定的主要手段是质谱技术，主要借助两种质谱技术实现蛋白质分析和鉴定：基质辅助激光解吸附飞行时间质谱和电喷雾离子阱质谱，蛋白质或多肽通过质谱离子源发生电离后，经质量分析器得出蛋白质的分子量或肽质量指纹图谱，再使用数据库检索出对应的蛋白质或多肽。目前，蛋白质组学的研究手段逐渐由传统的双向电泳法转向多维液相色谱，其中具有代表性的方式是自上而下策略和自下而上策略，自上而下策略是指以完整蛋白质混合物为研究对象，通过多种组合式手段分离，然后对单个蛋白质进行酶解和质谱分析。自下而上策略是将蛋白质首先酶解成20个氨基酸长度的多肽，形成比蛋白质更为复杂的多肽混合物，经过多维液相色谱正交分离后用于串联质谱鉴定，获得多肽序列，再搜索蛋白质数据库确定最后的鉴定结果。在实际的蛋白质组学实验中，不管采用哪种分析策略，都包含蛋白质酶解这一步骤，目前，针对蛋白质分离和鉴定都以效率可控的程序化方案，但对于蛋白质酶解等样品制备工作缺少稳定手段，严重影响蛋白质大规模鉴定的速度。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是针对蛋白质组学研究中的多肽样品制备方法，改进了蛋白质酶解体系，采用三氟乙醇作为主要酶解试剂，碳酸氢铵控制酶解体系的pH值，使得到的肽段漏切点更少。本专利技术还有一目的是提供一种自制电极，对蛋白质溶液进行电泳的预处理，改变蛋白质的三维结构，加快蛋白质酶解的速度。本专利技术另一个目的是利用酶解蛋白质的方法，酶解待鉴定的蛋白质，得到一种多肽样品，使多肽样品在液相色谱-串联质谱中鉴定为何种蛋白质时更准确，速度更快。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种酶解蛋白质的方法，将蛋白质加水搅拌均匀，放入电泳槽，在80-120V电压下电泳，电泳结束后收集蛋白质溶液，使用含有三氟乙醇的酶解缓冲溶液溶解蛋白质，之后对蛋白质进行还原和烷基化处理，将处理后的蛋白质溶液调节pH至7.5-8.5，然后加入占整个溶液体积90％-98％的胰蛋白酶，酶解，得到多肽产物；其中，电泳槽中的工作电极为氧化还原酶和锌铝层状双氢氧化物修饰的电极。优选的是，其中，所述酶解缓冲溶液由碳酸氢铵、三氟乙醇和乙腈按质量比为2∶40-60∶8-15组成。优选的是，其中，调节pH值的试剂为质量分数为2％-4％的碳酸氢铵溶液。优选的是，其中，具体包括以下步骤：步骤一、制备工作电极；步骤二、将蛋白质加水搅拌均匀，倒入电泳槽的阴极，在80-120V电压下电泳，电泳结束后在电泳槽的阳极收集蛋白质溶液；步骤三、将步骤二中所得的蛋白质溶液加入到所述酶解缓冲溶液中，其中，蛋白质和酶解缓冲溶液的质量比为1∶20-30，并用超声波处理3-5分钟；步骤四、在步骤三中所得蛋白质溶液中加入6-15mmol/L的二硫苏糖醇，在55-65℃下静置30-60分钟；步骤五、在步骤四中所得蛋白质溶液中加入15-25mmol/L的碘乙酰胺，在室温下静置20-40分钟；步骤六、在步骤五中所得蛋白质溶液中加入40mmol/L碳酸氢铵调节pH至8；步骤七、在步骤六中所得蛋白质溶液中加入占整个溶液体积90％-98％胰蛋白酶，在50℃-60℃下酶解3.5-4.5h，即可获得酶解后的多肽产物。优选的是，其中，当利用超声波处理步骤三中的溶液时，每处理10-15秒，间歇4-6秒。优选的是，其中，将步骤七中的酶解液在90℃下灭酶处理18-20分钟。优选的是，其中，所述工作电极的制备方法为：步骤a、对玻碳电极进行预处理；步骤b、取氧化还原酶溶于乙醇，超声混合，得到混合液，取5μL混合液滴到步骤a得到的玻碳电极表面，然后红外干燥烘干，冷却至室温备用；步骤c、将锌铝层状双氢氧化物包覆于步骤b得到的电极表面，在140℃下加热处理6-8小时，即得所述工作电极。本专利技术至少包括以下有益效果：针对蛋白质组学研究中的多肽样品制备方法，改进了蛋白质酶解体系，采用三氟乙醇作为主要酶解试剂，使用碳酸氢铵控制酶解体系的pH值，三氟乙醇具备极好的物理性质和热力学性质，具有充分溶解多肽的特殊性质，化学上具有醇类的典型性质，不会破坏多肽的一级结构，但三氟乙醇只能作为溶剂，不能保持环境pH值，因此需要碳酸氢铵控制溶液的中性环境。本专利技术得到适合液相色谱-串联质谱分析肽段所用的酶解方法，为蛋白质组学分析提供稳定可靠的样品制备技术。同时本专利技术通过氧化还原酶和锌铝层状双氢氧化物修饰的电极对蛋白质在酶解前进行电泳，改变蛋白质的三维结构，同时没有破坏多肽的一级结构，且利用该电极电泳后的蛋白质加入到酶解缓冲溶液中后，能够提高蛋白质在酶解缓冲溶液中的酶解活性，使蛋白质在后期酶解时速度更快，酶解更充分。本专利技术酶解高效、步骤简单，可以用于各种生物样品总蛋白质的蛋白质酶解前处理，实现了蛋白质的有效酶解并减少漏切位点，可以替代传统的有机溶剂酶解体系。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为利用纳升液相色谱采集实验组A和实验组B的总离子流；图2为实验组A和实验组B获得的肽段数、修饰位点数和漏切位点数。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。<实施例1>一种酶解蛋白质的方法，将蛋白质加水搅拌均匀，放入电泳槽，在80V电压下电泳，电泳结束后收集蛋白质溶液，使用含有三氟乙醇的酶解缓冲溶液溶解蛋白质，之后对蛋白质进行还原和烷基化处理，将处理后的蛋白质溶液调节pH至7.5，然后加入占整个溶液体积90％的胰蛋白酶，酶解，得到多肽产物；其中，电泳槽中的工作电极为氧化还原酶和锌铝层状双氢氧化物修饰的电极。其中，所述酶解缓冲溶液由碳酸氢铵、三氟乙醇和乙腈按质量比为2∶40∶8组成。其中，调节pH值的试剂为质量分数为2％的碳酸氢铵溶液。其中，具体包括以下步骤：步骤一、制备工作电极；步骤二、将蛋白质加水搅拌均匀，倒入电泳槽的阴极，在80V电压下电泳，电泳结束后在电泳槽的阳极收集蛋白质溶液；步骤三、将步骤二中所得的蛋白质溶液加入到所述酶解缓冲溶液中，其中，蛋白质和酶解缓冲溶液的质量比为1∶20，并用超声本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶解蛋白质的方法，其特征在于，将蛋白质加水搅拌均匀，放入电泳槽，在80‑120V电压下电泳，电泳结束后收集蛋白质溶液，使用含有三氟乙醇的酶解缓冲溶液溶解蛋白质，之后对蛋白质进行还原和烷基化处理，将处理后的蛋白质溶液调节pH至7.5‑8.5，然后加入占整个溶液体积90％‑98％的胰蛋白酶，酶解，得到多肽产物；其中，电泳槽中的工作电极为氧化还原酶和锌铝层状双氢氧化物修饰的电极。

【技术特征摘要】
1.一种酶解蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、制备工作电极，工作电极为氧化还原酶和锌铝层状双氢氧化物修饰的电极；步骤二、将蛋白质加水搅拌均匀，倒入电泳槽的阴极，在80-120V电压下电泳，电泳结束后在电泳槽的阳极收集蛋白质溶液；步骤三、将步骤二中所得的蛋白质溶液加入到所述酶解缓冲溶液中，其中，蛋白质和酶解缓冲溶液的质量比为1:20-30，所述酶解缓冲溶液由碳酸氢铵、三氟乙醇和乙腈按质量比为2:40-60:8-15组成，并用超声波处理3-5分钟；步骤四、在步骤三中所得蛋白质溶液中加入6-15mmol/L的二硫苏糖醇，在55-65℃下静置30-60分钟；步骤五、在步骤四中所得蛋白质溶液中加入15-25mmol/L的碘乙酰胺，在室温下静置20-40分钟；步骤六、在步骤五中所得蛋白质溶液中加入40mmol/L碳酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘丽梅，韦荣昌，付强，马小军，白隆华，黄芩芬，
申请(专利权)人：广西壮族自治区药用植物园，
类型：发明
国别省市：广西;45