【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物核酸检测，更具体地说，本专利技术涉及一种以磁珠作为待检物载体的核酸扩增检测方法及其应用。
技术介绍
1、常用的病原体核酸检测方法是荧光聚合酶链式反应法(pcr)，其它还有环介导等温扩增反应(lamp)、crispr-cas扩增反应和重组酶聚合酶扩增反应等。在这些检测反应中，病原体核酸提取往往需要在扩增反应前完成，进而采用核酸提取物进行核酸扩增，完成检测反应。目前常用的病原体核酸提取方法有有机萃取法、层析柱离心分离法、粗裂解分离法和磁珠法，其中有机萃取法通过有机萃取以及rna沉淀获得分离核酸；层析柱离心分离法通过将预处理的样品装载到旋转柱上，然后进行洗涤及柱外洗脱获取分离的核酸；粗裂解分离法通过裂解液裂解细胞进行核酸检测，主要用于培养细胞；磁珠法通过将预处理的样本与超顺磁性制备的磁珠混合，使核酸与磁珠结合，清洗磁珠表面其它残留物，然后洗脱核酸、扩增，依赖荧光法检测的特殊、庞大、昂贵光学仪器等，进行操作。
2、可见，目前采用的方法均为完成核酸提取和洗脱后，取少量的核酸提取液进行核酸扩增检测，未能实现检测灵敏度提升的最大化。因此，开发便于手工操作的核酸提取技术并实现将核酸提取物用于检测反应的最大化，具有重要的现实意义。
技术实现思路
1、本专利技术的一个目的是解决至少上述缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
2、本专利技术提供了以磁珠作为待检物载体的核酸扩增检测方法，包括步骤如下：
3、1)在含有待检核酸的试管中加入核酸提取专用磁珠，摇
4、2)所述核酸-磁珠复合物经制备提取后不经过核酸洗脱过程，将清洗后的所述核酸-磁珠聚集结构从试管中取出，放入含有核酸扩增反应液的试管中，移除所述套筒状磁分离结构的磁性内芯，摇振，所述核酸-磁珠复合物从所述套筒状磁分离结构的非磁性外套的外周壁上脱落，进入所述核酸扩增反应液内；
5、3)将所述套筒状磁分离结构的外套从含有核酸扩增反应液的试管中移除并盖上试管盖，移置于核酸扩增仪上进行核酸扩增反应，形成核酸扩增反应物；
6、4)形成的所述核酸扩增反应物采用目测检测进行结果判读，所述目测检测为通过肉眼可分辩的检测方法。
7、优选的是，目测检测包括染料变色法和胶体金显色法中的一种或两种，其中：
8、所述染料变色法为在所述核酸扩增反应液内加入扩增副产物焦磷酸根离子敏感性变色染料，通过肉眼观察颜色变化判断结果；
9、所述胶体金显色法为所述核酸扩增反应液中的引物包含有5’端标记抗原a基团的前内引物、5’端标记抗原b基团的后内引物，检测相为胶体金免疫检测试纸条，采用抗抗原a抗体和抗抗原b抗体相结合的双抗体夹心法进行检测，胶体金标记的抗抗原抗体作为指示剂，非标记的对应的抗抗原抗体作为捕获剂。
10、优选的是，核酸扩增反应为环介导等温扩增反应，所述核酸扩增反应液为完成核酸扩增所用的反应混合液相。
11、优选的是，目测检测为胶体金显色法时，所述核酸扩增反应的环介导等温扩增反应为在核酸扩增反应液中含有前外引物、后外引物、促环引物、5’端标记抗原a基团的前内引物、5’端标记抗原b基团的后内引物、dntps溶液、dna聚合酶以及环介导等温扩增缓冲液；检测相为胶体金免疫检测试纸条，采用双抗体夹心法进行检测，胶体金标记的抗抗原抗体作为指示剂，非标记的对应的抗抗原抗体作为捕获剂。
12、优选的是，目测检测为染料变色法时，所述核酸扩增反应的环介导等温扩增反应为在核酸扩增反应液中含有前外引物、后外引物、促环引物、前内引物、后内引物、dntps溶液、dna聚合酶以及环介导等温扩增缓冲液；检测相为扩增副产物焦磷酸根离子敏感性变色染料。
13、优选的是，套筒状磁分离结构包括内芯、外套和连接结构；所述连接结构设置在所述外套的上端开口上，用于使所述外套与试管形成密封闭合连接和解除闭合连接；当内芯插入外套内时，所述外套的外周产生磁力以将试管内的核酸-磁珠复合物吸持在所述外套的外周；当将所述内芯从所述外套中移除时，所述外套外周的磁力消失使外套外周对核酸-磁珠复合物失去吸持力。
14、优选的是，连接结构包括用于与试管上端开口密封盖合的管盖、以及在所述管盖上开设有用于给所述内芯拔插的套筒入口；所述管盖为带有內插式挤压嵌合结构的试管盖、或者带有外盖推压式盖状结构的试管盖、或者带有螺纹式旋进盖状结构的试管盖。
15、本专利技术还提供了核酸检测方法在开发核酸检测产品中的应用。
16、本专利技术的有益效果：
17、首先，本专利技术在完成磁珠核酸吸附提取过程后，直接将吸附有核酸的磁珠释放到核酸扩增反应液内进行核酸扩增反应，这样不仅可以避免核酸洗脱转移所带来的污染风险，更重要的是提高了核酸扩增反应液内的模板浓度，增加了检测灵敏度。
18、其次，本专利技术采用套筒状磁分离结构吸附提取待检核酸，实现磁珠法核酸提取过程的完全手动控制，便于操作。
19、再有，本专利技术所述核酸扩增反应包括聚合酶链式反应、环介导等温扩增反应、crispr-cas扩增反应和重组酶聚合酶扩增反应中的至少一种，可以适用于现有的核酸扩增反应的全部实验，实用性强。
20、再有，本专利技术的核酸扩增反应过程中，磁珠始终保留在扩增反应液内，所设置的扩增反应结果检测能在反应管外显示，便于观测结果。
21、本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
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1.以磁珠作为待检物载体的核酸扩增检测方法，其特征在于，包括步骤如下：
2.如权利要求1所述的以磁珠作为待检物载体的核酸扩增检测方法，其特征在于，所述目测检测包括染料变色法和胶体金显色法中的一种或两种，其中：
3.如权利要求2所述的以磁珠作为待检物载体的核酸扩增检测方法，其特征在于，所述核酸扩增反应为环介导等温扩增反应，所述核酸扩增反应液为完成核酸扩增所用的反应混合液相。
4.如权利要求3所述的以磁珠作为待检物载体的核酸扩增检测方法，其特征在于，所述目测检测为胶体金显色法时，所述核酸扩增反应的环介导等温扩增反应为在核酸扩增反应液中含有前外引物、后外引物、促环引物、5’端标记抗原A基团的前内引物、5’端标记抗原B基团的后内引物、dNTPs溶液、DNA聚合酶以及环介导等温扩增缓冲液；检测相为胶体金免疫检测试纸条，采用双抗体夹心法进行检测，胶体金标记的抗抗原抗体作为指示剂，非标记的对应的抗抗原抗体作为捕获剂。
5.如权利要求3所述的以磁珠作为待检物载体的核酸扩增检测方法，其特征在于，所述目测检测为染料变色法时，所述核酸扩增反应的环介导等温
6.如权利要求1-5任一项所述的以磁珠作为待检物载体的核酸扩增检测方法，其特征在于，所述套筒状磁分离结构包括所述内芯、所述外套和连接结构；所述连接结构设置在所述外套的上端开口上，用于使所述外套与试管形成密封闭合连接和解除闭合连接；当内芯插入外套内时，所述外套的外周产生磁力以将试管内的核酸-磁珠复合物吸持在所述外套的外周；当将所述内芯从所述外套中移除时，所述外套外周的磁力消失使外套外周对核酸-磁珠复合物失去吸持力。
7.如权利要求6所述的以磁珠作为待检物载体的核酸扩增检测方法，所述连接结构包括用于与试管上端开口密封盖合的管盖、以及在所述管盖上开设有用于给所述内芯拔插的套筒入口；所述管盖为带有內插式挤压嵌合结构的试管盖、或者带有外盖推压式盖状结构的试管盖、或者带有螺纹式旋进盖状结构的试管盖。
8.如权利要求1-5或7任一项所述的核酸扩增检测方法在开发核酸检测产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.以磁珠作为待检物载体的核酸扩增检测方法，其特征在于，包括步骤如下：
2.如权利要求1所述的以磁珠作为待检物载体的核酸扩增检测方法，其特征在于，所述目测检测包括染料变色法和胶体金显色法中的一种或两种，其中：
3.如权利要求2所述的以磁珠作为待检物载体的核酸扩增检测方法，其特征在于，所述核酸扩增反应为环介导等温扩增反应，所述核酸扩增反应液为完成核酸扩增所用的反应混合液相。
4.如权利要求3所述的以磁珠作为待检物载体的核酸扩增检测方法，其特征在于，所述目测检测为胶体金显色法时，所述核酸扩增反应的环介导等温扩增反应为在核酸扩增反应液中含有前外引物、后外引物、促环引物、5’端标记抗原a基团的前内引物、5’端标记抗原b基团的后内引物、dntps溶液、dna聚合酶以及环介导等温扩增缓冲液；检测相为胶体金免疫检测试纸条，采用双抗体夹心法进行检测，胶体金标记的抗抗原抗体作为指示剂，非标记的对应的抗抗原抗体作为捕获剂。
5.如权利要求3所述的以磁珠作为待检物载体的核酸扩增检测方法，其特征在于，所述目测检测为染料变色法时，所述核酸扩增反应的环介导等温扩...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘凤鸣，师凤华，谭木秀，
申请(专利权)人：广西壮族自治区药用植物园，
类型：发明
国别省市：
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