全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的试剂盒及方法，试剂盒包括生物素化抗原、磁分离试剂、碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体、发光底物、校准品、质控品和清洗液，生物素化抗原为偶联有生物素的PR3抗原，磁分离试剂为表面具有亲和素活性基团的磁微粒悬浮液，发光底物为碱性磷酸酶的化学发光底物，采用此试剂盒对抗蛋白酶3抗体IgG进行全自动测定。通过上述方式，本发明专利技术是一种独立的、单人份的、一次性的用于磁微粒化学发光检测抗蛋白酶3抗体IgG的分析方法。通过这种方法可以更方便快捷的根据检测项目的使用需要进行相关的免疫学检测，为临床应用提供了更好的依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及磁微粒化学发光免疫诊断
，特别是设及一种全自动测定抗蛋 白酶3抗体IgG的试剂盒及方法。
技术介绍
蛋白酶3 (Proteinase 3, PR3)是中性粒细胞胞浆嗜天青颗粒中的一种丝氨酸蛋 白酶，分子量约为29KDa的糖蛋白。PR3能降解多种细胞外基质如弹性蛋白、血红蛋白、IV 型胶原等多种组织成分。此外，蛋白酶3通过组织蛋白酶G促进血小板活化，并使C1抑制 剂失活。 ANCA产生的巧光模式包括胞浆型（cANCA)、核周型（pANCA)。抗中性粒细胞胞质抗 体（antineutro地il(cytoplasmicantibodies.ANCA)是目前用于诊断原发性小血管炎 最重要的血清学检测指标，蛋白酶3是cANCA的主要祀抗原在间接免疫巧光法检测用乙醇 固定的中性粒细胞呈cANCA巧光模式，约占C-ANCA的80 %~90 %。 韦格纳肉芽肿（Wegener'Sgranulomatosis,WG)是一种特殊类型的坏死性肉芽 肿性血管炎。其临床的复杂性和诊治的困难性一直是困扰风湿病专科医师的问题。WG的诊 断主要依据临床症状，而临床表现复杂多样、因人而异。抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA)是 对WG最有诊断意义的自身抗体。 阳〇化]过去WG的诊断主要是根据典型的临床表现和病史，但有些患者，尤其是限局性的 患者很难诊断，病检是确诊WG的重要手段。但一次或单部位病检阴性并不能排除WG。目 前的研究认为大部分WG患者的ANCA特异性祀抗原是PR3,抗PR3抗体与WG的诊断和疾病 活动密切相关。胞浆型ANCA(巧toplasmicANCA，cANCA)和抗PR3抗体对WG诊断意义有 高度的敏感性和特异性。国外报道在活检证实为WG的患者中，抗PR3抗体特异性为90% W上。敏感性是与疾病的活动性有关。通常抗PR3抗体滴度与疾病活动一致，活动性WG患 者在病变尚未影响到呼吸系统时抗PR3抗体敏感性是65%，当患者出现呼吸系统、肾脏损害 时其灵敏度达90%W上。活动期滴度较高，部分缓解期滴度很低，完全缓解的患者多数测不 至IJ。缓解期抗PR3抗体滴度的升高可能预示着复发，并且有助于将感染和复发区分开。 对于此病的检测方法主要为间接免疫巧光法和酶联免疫吸附法，但运些方法都存 在着不足之处。 一、间接免疫巧光法：该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后， 继用间接巧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体巧光复合物。在巧光显微 镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。该方法评价：由于结合在抗原抗体复合 物上的巧光素抗体增多，发出的巧光亮度强，因而其敏感性强。但是其不足也是明显的： (1)运用此法可能出现假阳性。 (2)在分析结果时无法根据分子量的大小区分非特异性识别。 (3)操作相对复杂，需要价格较昂贵的巧光显微镜，在很多基层医院难W推广，也 不太适用于标本量较多的实验室。 (4)巧光测定中的本底较高，巧光免疫技术用于定量测定有一定困难。 (5)结果判定需要有经验的专业人员，分析结果的客观性不足。 二、酶联免疫吸附法：ELISA检测抗PR3抗体，简便易行，特异性高，与间接免疫巧 光法联合检测，可为临床对WG的诊断和治疗提供更为客观的实验依据。但与其他生物检 测或免疫检测比较，运种ELISA检测方法、技术、工具或产品仍有较多的不足而使其应用受 限，运些不足主要包括W下几个方面： (1) 检测试剂在检测过程中为开放方式，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检 测结果； (2) 化ISA方法多采用辣根过氧化物酶进行检测，其检测范围和灵敏度都较低。 (3化LISA方法的检测时间通常反应是一件较长，完成一个测试所需的总时间一般 在2个小时W上，不能完全满足临床上的快速诊断的需求。 (4)通常化ISA方法所用的试剂较多，通常在11种试剂左右，在临床检查过程中， 极易出现试剂混用造成结果判读无效的情况。 通常测定蛋白酶3抗体IgG的方法为酶联免疫分析法，此方法采用的是辣根过氧 化物酶系统，将待测样品中的待测抗蛋白酶3抗体IgG与高度纯化的人蛋白酶3抗原进行 反应而形成第一免疫络合物，该第一免疫络合物与酶标记的第二抗体进行反应形成第二免 疫络合物，将反应形成的第二络合物与显色底物进行显色对比分析，从而获得待测抗蛋白 酶3抗体IgG的含量。本方法采用的辣根过氧化物酶的灵敏度相比某些酶的灵敏度低10 倍左右，而且酶联免疫检测方法的反应时间较长，通常完成一个测试大概在2个小时左右。 实验中操作比较繁琐。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的试剂盒 及方法，其节省时间、灵敏度高、结果准确、实现全自动测定。 为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：提供一种全自动测定抗蛋 白酶3抗体IgG的试剂盒，包括生物素化抗原、磁分离试剂、碱性憐酸酶标记的抗人IgG抗 体、发光底物、抗PR3抗体校准品、抗PR3抗体质控品和清洗液，所述生物素化抗原为偶联 有生物素的PR3抗原，所述磁分离试剂为表面具有亲和素活性基团的磁微粒悬浮液，所述 发光底物为碱性憐酸酶的化学发光底物。[001引在本专利技术一个较佳实施例中，所述磁分离试剂的磁微粒的直径为0. 1-0. 5μm;所 述磁分离试剂为磁珠原液用憐酸盐缓冲液洗涂后稀释浓度为0. 4μg/mL。 在本专利技术一个较佳实施例中，所述碱性憐酸酶标记的抗人IgG抗体为将碱性憐酸 酶与抗人IgG抗体偶联，用MES缓冲液稀释浓度为0. 1μg/mL。 在本专利技术一个较佳实施例中，所述发光底物为AMPPD溶液。 提供一种全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的检测方法，包括步骤为：（1)往反应杯 中依次加入生物素化抗原、磁分离试剂和血清样本进行解育，再用清洗液在磁场作用下清 洗；（2)往步骤（1)清洗后的反应杯中加入碱性憐酸酶标记的抗人IgG抗体解育，再用清洗 液在磁场作用下清洗；（3)往步骤（2)清洗后的反应杯中加入发光底物解育，检测发光信号 值，并通过拟合曲线计算血清样本中抗PR3抗体IgG的浓度。 在本专利技术一个较佳实施例中，所述生物素化抗原、所述磁分离试剂、所述血清样 本、所述碱性憐酸酶标记的抗人IgG抗体、所述发光底物的加入体积比为：5:5:2:13:18。 在本专利技术一个较佳实施例中，步骤（1)中所述血清样本与稀释液按照体积比1:19 进行混合稀释。 在本专利技术一个较佳实施例中，步骤（1)中所述解育是在37°C下溫育15min，步骤 (2)所述解育是在37°C下溫育15min，步骤（3)中所述解育是在37°C下溫育5min。在本专利技术一个较佳实施例中，所述检测方法采用碱性憐酸酶系统，为全自动化检 测。 本专利技术的有益效果是：本专利技术基于磁微粒化学发光检测的原理来实现抗蛋白酶3 抗体IgG的免疫检测的方法，是一种独立的、单人份的、一次性的用于磁微粒化学发光检测 抗蛋白酶3抗体IgG的分析方法。通过运种方法可W更方便快捷的根据检测项目的使用 需要进行相关的免疫学检测，为临床应用提供了更好的依据。【附图说明】 为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全自动测定抗蛋白酶3抗体IgG的试剂盒，其特征在于，包括生物素化抗原、磁分离试剂、碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体、发光底物、抗PR3 抗体校准品、抗PR3 抗体质控品和清洗液，所述生物素化抗原为偶联有生物素的PR3抗原，所述磁分离试剂为表面具有亲和素活性基团的磁微粒悬浮液，所述发光底物为碱性磷酸酶的化学发光底物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王健，柳乐，秦枫，赵转，崔利歌，廖锡文，谢云，马竹枫，王静，赵婷，黄琪，张伟，徐娟，
申请(专利权)人：苏州浩欧博生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32