本发明专利技术公开了一种产凝乳酶的重组毕赤酵母及其应用，属于酶工程技术领域。本发明专利技术构建的重组毕赤酵母，是将自筛的Bacillus amyloliquefaciens JNU002的凝乳酶基因cMCE导入毕赤酵母GS115中获得凝乳酶的重组菌。本发明专利技术应用该重组菌进行发酵，并通过每12h流加12g/L的蛋白胨，提高了发酵液中凝乳酶的酶活，使凝乳酶活相对于改进前提高了6.8倍。该方法制备的凝乳酶杂蛋白少，易纯化，安全性好，适于工业生产。
A recombinant Pichia pastoris producing chymosin and its application
The invention discloses a recombinant Pichia pastoris producing chymosin and its application, and belongs to the technical field of enzyme engineering. The recombinant Pichia pastoris recombinant bacteria from the Bacillus amyloliquefaciens JNU002 screen chymosin gene cMCE into Pichia pastoris GS115 obtain chymosin. The application of the fermentation of recombinant strain, and through each 12h flow and 12g/L peptone, improve the fermentation broth of rennet enzyme, the curd enzyme activity increased 6.8 times compared with before improvement. The rennet enzyme prepared by the method has few impurities, is easy to purify and has good safety, and is suitable for industrial production.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种产凝乳酶的重组毕赤酵母及其应用，属于酶工程
技术介绍
凝乳酶是一种最早在未断奶的小牛胃中发现的天门冬氨酸蛋白酶，可专一地切割乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106之间的肽键，破坏酪蛋白胶束使牛奶凝结，凝乳酶的凝乳能力及蛋白水解能力使其成为干酪生产中形成质构和特殊风味的关键性酶，被广泛地应用于奶酪和酸奶的制作。细菌生长周期短，但是存在发酵过程中生物量偏少，目的蛋白含量少难于分离提取，蛋白水解能力强，菌种不符合工业生产安全要求等多方面问题，所以找到合适的真菌宿主异源表达细菌源凝乳酶很有必要。最近，我国也在基因工程凝乳酶的研究方面获得了一定的进展。冯镇等(2008)将牛凝乳酶基因在乳酸克鲁维酵母中表达，得到了具有凝乳活性的凝乳酶。邱重晏等(2005)也将微小毛霉凝乳酶在巴斯德毕赤酵母中进行表达，所获重组菌种在诱导96-102h后，酶活性达到5.4SSU/mL。王博达等尝试在大肠杆菌中异源表达凝乳酶，但重组菌分泌到胞外的凝乳酶活力仅为4.67SU·mL(《一种细菌凝乳酶基因的克隆及表达的研究》，2015年)。研究并构建一种能够高效表达并高产能够分泌到胞外的凝乳酶的基因工程菌对于凝乳酶的工业化生产具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种表达细菌来源凝乳酶的重组毕赤酵母，是以pPIC9K为载体，在毕赤酵母中表达SEQIDNO.1所示基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母是以毕赤酵母GS115为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，所述SEQIDNO.1所示的基因来源于BacillusamyloliquefaciensJNU002，已于中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCCNO:M2011045。本专利技术的第二个目的是提供所述重组毕赤酵母的构建方法，是以pPIC9K为载体，将SEQIDNO.1的基因在毕赤酵母中进行表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：1)在酵母表达载体的多克隆位点插入凝乳酶基因构建重组酵母表达载体；2)将所述重组酵母表达载体导入毕赤酵母中获得表达凝乳酶的重组菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述酵母表达载体为pPIC9K。所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。本专利技术的第三个目的是提供一种凝乳酶的生产方法，所述方法是将所述重组菌接种至发酵培养基中，30℃培养48～96h。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基为BMMY培养基，每L含有：10g/L酵母粉，20g/L蛋白陈，3g/L磷酸氢二钾，11.8g/L磷酸二氢钾，13.4g/LYNB，4×10-4g/L生物素，5ml/L甲醇。在本专利技术的一种实施方式中，每12h添加终浓度0.5％(v/v)的甲醇进行诱导。本专利技术的第四个目的是提供一种提高凝乳酶产量的方法，是在所述生产方法的基础上，每12h加入12～14g/L的蛋白胨。本专利技术还提供所述方法在制备含凝乳酶的产品中的应用。有益效果：(1)本专利技术改善了甲醇诱导表达培养基，减少了目的蛋白的损耗，提高了单位发酵液的酶活，使分泌到胞外的凝乳酶活达到122SU/L，为工业生产创造了更大的商业价值；(2)本专利技术首次在毕赤酵母表达系统中分泌表达了解淀粉芽孢杆菌源凝乳酶，使其在胞外分泌表达，无需破碎细胞且培养基中杂蛋白含量极低，纯化步骤简单，适宜工业化生产。毕赤酵母适合于工业规模的高密度发酵，培养基廉价，操作简单，产物具有很好的生物安全性，适用于食品和医药等领域。附图说明图1为EcoRI和NotI双酶切鉴定重组菌凝胶电泳图；1～5，酶切后的重组转化子；M1，2000bpMarker；M2，10000bpMarker；图2为SacI酶切位点线性化琼脂糖凝胶图；1，SacI酶切后；2，重组载体pPIC9K-cMCE；M：10000bpMarker；图3为转化子菌落PCR验证的结果；M1，2000bpMarker；M2，10000bpMarker；1～11，重组转化子图4为酵液上清的SDS-PAGE电泳检测结果；M，marker；1，诱导96小时毕赤酵母P-cMCE的发酵液浓缩上清图5为每12h流加不同浓度的蛋白胨对凝乳酶活的影响具体实施方式凝乳酶酶活测定：采用Arima方法，1ml上清液35℃保温5min，加入到于35℃保温10min的5mL10％脱脂牛奶中，计时，至管壁出现颗粒为止。记录凝乳时间T。酶活定义：在35℃温度下，40min凝乳1mL10％脱脂乳的酶量为一个酶活单位(SU)。按如下公式计算凝乳酶活力：凝乳酶活力＝[(5×2400)/(0.5×T)]×n；其中：T为凝乳时间(s)，n为稀释倍数。实验重复3次，结果以三次重复的平均值表示。培养基：BMGY培养基：10g/L酵母粉，20g/L蛋白陈，3g/L磷酸氢二钾，11.8g/L磷酸二氢钾，13.4g/LYNB，4×10-4g/L生物素，10g/L甘油。BMMY培养基：10g/L酵母粉，20g/L蛋白陈，3g/L磷酸氢二钾，11.8g/L磷酸二氢钾，13.4g/LYNB,4×10-4g/L生物素，5ml/L无水甲醇。MM培养基：13.4g/LYNB，4×10-4g/L生物素，5ml/L甲醇，15g/L琼脂。MD培养基：13.4g/LYNB，4×10-4g/L生物素，20g/L葡萄糖，0.4g/L组氨酸，15g/L琼脂。实施例1(1)解淀粉芽孢杆菌凝乳酶cMCE的克隆在500mL摇瓶里培养BacillusamyloliquefaciensJNU002至OD600于3.0左右，取1.5mL发酵液，12000rpm离心30s，再用无菌水洗涤两次。加入600μL无菌水重悬，再加入15μL溶菌酶(10mg/mL)，37℃水浴30min。加入60μL10％SDS混匀后立即添加10uL蛋白酶K(20mg/mL)，65℃水浴2～6h。取600μL处理液于新管，加入等体积酚氯仿，12000rpm，离心5min，取上清，加入等体积的酚氯仿，抽提2～4次，直到白色沉淀较少，取上清，加入等体积的氯仿，抽提2次。混入1/10体积的乙酸钾(10mol/L)，加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀染色体，晾干乙醇，溶于50μL无菌水中，琼脂糖凝胶电泳验证并4℃保存染色体。根据cMCE序列1来设计引物P1和P2，扩增凝乳酶基因cMCE，引物P1和P2的核苷酸序列如下：P1(p9K-EcoRI-F)：5’CCGGAATTCGTGAGAGGCAAAAAAGTATG3'P2(p9K-NotI-R)：5'ATAAGAATGCGGCCGCTTACTGAGCTGCCGCCTGTA3'PCR反应体系如下:superpfuPCRMasterMix50μL,ddH2O50μL，20μM/LP12μL,20μM/LP22μL，总体积100μL，分装10管，每管10μL。反应条件:94℃预变性5min，94℃变性30s，45℃/68℃(8个梯度)退火30s，72℃延伸80s、29次circle，72℃延伸10min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选择8个梯度中最合适的退火温度，按照原来的体系进行PCR。由于使用superpfu作为DNA聚合酶，PCR产物没有粘本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达细菌来源凝乳酶的重组毕赤酵母，其特征在于，以pPIC9K为载体，在毕赤酵母中表达SEQ ID NO.1所示基因。
【技术特征摘要】
1.一种表达细菌来源凝乳酶的重组毕赤酵母，其特征在于，以pPIC9K为载体，在毕赤酵母中表达SEQIDNO.1所示基因。2.根据权利要求2所述的重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母是以毕赤酵母GS115为宿主。3.权利要求1所述的重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，以pPIC9K为载体，将SEQIDNO.1的基因与载体连接，并在毕赤酵母中进行表达。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在酵母表达载体的多克隆位点插入SEQIDNO.1所示的编码凝乳酶的基因，构建重组酵母表达载体；(2)将所述重组酵母表达载体导入毕赤酵母GS115中获得表达凝乳酶的重组菌。5.一种凝乳...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁重阳，张琦，艾连中，王琼，杭锋，苑畅，石贵阳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。