本发明专利技术公开了一种表达脯氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母及其构建方法，属于生物工程技术及基因工程领域。本发明专利技术将来源于米曲霉的脯氨酸氨肽酶基因经过优化后整合到毕赤酵母染色体上，获得重组毕赤酵母GS115/pPIC9K‑pap，用该重组菌株能高效表达脯氨酸氨肽酶，经过摇瓶初步优化后发酵液上清中的酶活为5.6U/mL，胞内酶活为61.26U/mL，为工业化生产重组脯氨酸氨肽酶打下基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种表达脯氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母及其构建方法，属于生物工程技术及基因工程领域。
技术介绍
脯氨酸氨肽酶作为一种外切型蛋白酶，在食品、医药和化工等多种领域都有很重要的应用。可用于去除蛋白水解液中的苦味、蛋白质的深度水解、生物活性肽的制备及重组蛋白固定剂或蛋白序列测定所需的工具酶等，在食品、医药保健与化工行业应用前景广阔。米曲霉是一种广泛用于生产的发酵工业菌，其表达的脯氨酸氨肽酶具有良好的理化性质。但由于其表达量低，蛋白稳定性差，且纯化步骤繁琐，很难满足市场需求。目前对脯氨酸氨肽酶的异源表达研究主要集中于大肠杆菌等原核宿主，尽管提高了重组蛋白的表达量，但又存在以下缺点：1)不易分泌表达、易形成包涵体；2)产内毒素具有安全隐患，不适用于食品酶的生产；3)包含有目的基因的质粒易丢失，生产中需要添加大量抗生素，破坏了生态环境。因此，构建一株能高效稳定表达、遗传背景清晰且利于纯化的氨肽酶重组菌具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一株重组表达脯氨酸氨肽酶的毕赤酵母工程菌。所述毕赤酵母工程菌是以毕赤酵母GS115为表达宿主，以pPIC9K为表达载体，表达了核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的脯氨酸氨肽酶基因。所述SEQIDNO.2所示的脯氨酸氨肽酶基因，是对来自米曲霉的脯氨酸氨肽酶基因(SEQIDNO.1)进行优化后得到的。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种构建所述毕赤酵母工程菌的方法，主要包括以下步骤：(1)设计引物扩增SEQIDNO.2所示的目的基因；扩增得到的氨肽酶基因编码的氨肽酶的N-端含有组氨酸标签；(2)将PCR产物连接到表达载体pPIC9K上，获得重组质粒；(3)测序正确的重组载体用PmeI进行单酶切，经酶切线性化之后，同毕赤酵母感受态细胞混匀，进行电击转化，筛选获取重组毕赤酵母。本专利技术还提供一种应用所述毕赤酵母工程菌发酵生产脯氨酸氨肽酶的方法，主要包括以下步骤：①挑取YPD平板上活化的菌落于25mLBMGY培养基中，30℃、230rpm培养20h；②将培养液置于无菌离心管中离心收集沉淀，将沉淀重溶于25mLBMMY培养基中30℃培养168h，每隔24h向培养液中添加终浓度0.5％的甲醇进行甲醇诱导；③将获得的发酵液，离心收集上清，即为氨肽酶胞外粗酶液，菌体沉淀稀释一定倍数后超声破碎，破碎液离心后即得胞内粗酶液。本专利技术对氨肽酶基因进行了优化，并首次在毕赤酵母中成功表达了重组脯氨酸氨肽酶。相比表达未经优化的氨肽酶基因的重组毕赤酵母，胞外酶活提高到1.66倍，胞内酶活提高到2.1倍。与该基因在原核宿主大肠杆菌中的胞内表达不同，脯氨酸氨肽酶在重组毕赤酵母中得到了部分分泌表达，且经过摇瓶初步优化后发酵液上清中的酶活为5.6U/mL，胞内酶活为61.26U/mL。本专利技术方法简单有效，构建的重组毕赤酵母能高效表达脯氨酸氨肽酶，且重组蛋白包含组氨酸标签，利于后期重组蛋白的纯化以及为进一步研究脯氨酸氨肽酶的特性、结构等提供所需蛋白。附图说明图1脯氨酸氨肽酶(pap)重组子的PCR验证(M：Marker，1-5：目的基因)图2重组质粒pPIC9K-pap的双酶切验证。(M：Marker，1-3：pPIC9K-pap重组质粒的双酶切，P：pPIC9K质粒)图3重组质粒pPIC9K-pap结构示意图图4重组脯氨酸氨肽酶的SDS-PAGE分析(M：标准蛋白Marker，1：P.pastorisGS115/pPIC9K-pap细胞沉淀破碎上清，2:目的蛋白)图5重组毕赤酵母的生长曲线图6诱导起始时间对脯氨酸氨肽酶产酶的影响图7甲醇浓度对酵母产脯氨酸氨肽酶的影响具体实施方式所用培养基：LB(g/L)：胰蛋白胨10，酵母膏5，NaCl10，pH7.0；YPD(g/L)：蛋白胨20，葡萄糖20，琼脂20；MD(g/L)：葡萄糖20，琼脂20，YNB13.4，生物素0.4；MM(g/L)：甲醇5mL/L，琼脂20，YNB13.4，生物素0.4；BMGY(g/L):蛋白胨20，甘油10，酵母膏10，YNB13.4，生物素0.4，100mM磷酸盐缓冲液pH6.0：BMMY(g/L):蛋白胨20，甲醇10，酵母膏10，YNB13.4，生物素0.4，100mM磷酸盐缓冲液pH6.0；T4DNA连接酶、限制性内切酶BglΙI、EcoRI、NotΙ和SalI以及共用Buffer购自宝生物工程(大连)有限公司。脯氨酸氨肽酶酶活测定方法：以L-脯氨酸-对硝基苯胺为底物，加入2mLpH7.5的Tris-HCl缓冲液，1mL稀释适当倍数的酶液和1mL底物(2mM)，50℃反应10min，在405nm处测定吸光值，计算酶活力。脯氨酸氨肽酶酶活定义：在一定条件下，每分钟分解L-脯氨酸-对硝基苯胺产生1μM的对硝基苯胺所需要的酶量，即为一个酶活单位。(其中Abs为405nm处吸光值)实施例1表达脯氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母的构建方法。为实现脯氨酸氨肽酶基因在毕赤酵母中的表达，根据脯氨酸氨肽酶基因设计引物。上游引物P1：5＇-CCGGAATTCATGGCTGCCAAACTAGTAGAC-3＇(下划线表示EcoRΙ酶切位点)；下游引物P2：5＇-ATAGTTTAGCGGCCGCCTAATCAATAGAGTCG-3＇(下划线表示NotΙ酶切位点)；以包含脯氨酸氨肽酶基因的pET-28a-pap质粒为模板，该质粒的构建方法记载于专利号为ZL201310656778.3、专利技术名称为“一株生产脯氨酸氨肽酶的基因工程菌及其构建方法”的专利中。P1及P2为引物扩增目的基因。PCR体系为(50μL)：PrimerSTAR酶25μL；pET-28a-pap质粒1μL；P11μL；P21μL；ddH2O22μL。PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s；72℃后延伸5min；33个循环。将扩增获得的目的基因与质粒pPIC9K用EcoRI及NotI双酶切，双酶切体系如下：双酶切体系(50μL)体系：目的基因/质粒16μL，限制酶各2μL，双蒸水10μL，10×H、BSABuffer各5μL。37℃双酶切反应5h，琼脂糖凝胶电泳35min后，胶回收目的条带。将双酶切后的目的基因与载体按摩尔质量比8:1的比率混合，16℃过夜并转化E.coliJM109。涂布于含氨苄抗性(100μg/mL)的LB培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株重组表达脯氨酸氨肽酶的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌是以毕赤酵母GS115为表达宿主，以pPIC9K为表达载体，表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的脯氨酸氨肽酶基因。
【技术特征摘要】
1.一株重组表达脯氨酸氨肽酶的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌是
以毕赤酵母GS115为表达宿主，以pPIC9K为表达载体，表达了核苷酸序列如SEQIDNO.2
所示的脯氨酸氨肽酶基因。
2.一种构建权利要求1所述毕赤酵母工程菌的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)设计引物扩增SEQIDNO.2所示的目的基因；扩增得到的氨肽酶基因编码的氨肽酶
的N-端含有组氨酸标签；
(2)将PCR产物连接到表达载体pPIC9K上，获得重组质粒；
(3)测序正确的重组载体用PmeI进行单酶切，经酶切线性化之后，同毕赤酵母感受态
细胞混匀，进行电击转化，筛选获取重组毕赤酵母。
3.一种应用权...
【专利技术属性】
技术研发人员：田亚平，杨宏宇，周楠迪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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