一种重组酵母菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，公开了一种重组酵母菌株及其构建方法和应用。所述重组酵母菌株敲除gal1、gal7、gal10以及ypl062w基因，且包含经酵母同源重组整合到基因组上的3个基因片段，在其基础上本发明专利技术还进一步敲除rox1基因以及整合到酵母基因组上2个基因片段，获得更优的重组酵母。本发明专利技术构建基因敲除酵母菌株，为生产番茄红素提供优化的宿主细胞，选取特定来源组合的合成番茄红素的功能基因crtE、crtB和crtI，及特定的酵母内源基因等，经模块化设计整合至基因敲除酵母菌株基因组上，获得一株全新的高产番茄红素的重组菌株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及一种重组酵母菌株及其构建方 法和应用。
技术介绍
在世界范围内，随着经济水平和对健康需求的提高，食品的安全性、营养性和功能 性受到越来越多的关注，因此功能性营养化学品已成为发展趋势，代表当代食品发展的新 潮流，具有广阔的市场前景。番茄红素是一种脂溶性天然食用色素，在化学结构上属于类胡 萝卜素，具备极强的抗氧化能力，是近年来国际上功能食品成分研究的热点。番茄红素的制备主要依赖植物提取、化学合成和微生物合成，前两种方法各有其 自身的不足，微生物合成则以低成本、高产量和产品安全性，被认为是最有前途的方法。目 前，在微生物合成番茄红素的研究中，所采用的宿主菌主要集中于大肠杆菌与酿酒酵母。 2011年，Yeong-SuKim等人在大肠杆菌中引入成团泛菌来源的合成番前红素三个基因 crtE、crtB和crtI，同时上调内源MEP途径中的关键基因并在胞内搭建异源MVA路径，最终通 过分批补料发酵优化实现1.35g/L( 32mg/gDCW)的番茄红素产量。2014年，天津工业生物技 术研究所马延和课题组通过优化大肠杆菌胞内NADPH和ATP的供给，并利用核糖体结合位点 文库筛选获得一株高产番茄红素的重组大肠杆菌，其在分批补料发酵罐上的产量为3.52g/ L(50.6mg/gDCW)，属目前公开报道的重组菌株中最高产量。 酿酒酵母作为公认的安全模式微生物，相比大肠杆菌，它的菌体维生素、蛋白质含 量高，可作食用、药用和饲料酵母;相比三孢布拉氏霉菌，它的生长周期更短且更易培养。因 此，实现番茄红素在酿酒酵母中的高产将会在类胡萝卜素产业化上展现极大的竞争力。2014 年Bahieldin等人报道的在酿酒酵母中通过ADH2启动子表达经密码子优化的噬夏孢欧文氏 菌来源的crtE、crtB和crtl的番茄红素产量仅SJmg/gDCWjOlS年，浙江大学于洪巍课题组 通过蛋白定向进化手段改造红发夫酵母来源的双功能酶crtYB，使其失去番茄红素环化酶 的编码功能，而仅保留其编码八氢番茄红素合成酶的功能；同时，对红发夫酵母来源的crtE 进行定向进化，提高酶的催化性能;再次，通过调整crtE、crtB和crtI的拷贝数，获得一株高 产番茄红素的二倍体重组酿酒酵母，其摇瓶产量达到159.56mg/L(23.23mg/gDCW)，最后通 过分批补料发酵优化，番茄红素的产量达到1 .61g/L(24.41mg/gDCW)。中国专利 CN105087406A公开了一种，其通过将酵母菌株敲除 gall、gal7、gall0或gal80基因，以及ypl062w基因构建基因敲除酵母菌株，然后选取不同来 源的合成番前红素的功能基因crtE、crtB和crtI，及特定的酵母内源基因等，经模块化设计 整合至基因敲除酵母菌株基因组上，获得一株全新的高产番茄红素的重组菌株，番茄红素 的产量达到30-45mg/gDCW，属目前公开报道的利用重组酿酒酵母合成番茄红素的最高产 量。然而，这与此前报道的利用重组大肠杆菌合成番茄红素的最高产量（50.6mg/g DCW)相比仍有一定差距。因此，开发以酿酒酵母为宿主菌株实现番茄红素的高产依然存在 很大的潜力与空间。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种重组酵母菌株，使得所述重组菌株能够应 用于番茄红素的生物合成中，并保持较高产量，同时提供所述重组菌株的构建方法和应用。 为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案： 一种重组酵母菌株，所述酵母基因组敲除gall、gal7、gal10和ypl062w基因，且包 含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段： 酵母trpl位点上游同源序列、CYC1终止子、BtcrtI、GAL10启动子、GAL1启动子、Pa crtB、PGKl终止子、酵母trpl位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段1(模式图见图1); 酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA 还原酶基因tHMGRl、GAL10启动子、GAL1启动子、TmcrtE、GPMl终止子、酵母leu2位点下游同 源序列顺次拼接而成的基因片段2(模式图见图2); 基因片段2中TDH2终止子及其上游同源序列、DR-K1URA3-DR营养标签、CYC1终止 子、BtcrtI、GAL7启动子、基因片段2中ACT1终止子及其下游同源序列顺次拼接而成的基因 片段3(模式图见图3)。 本专利技术通过利用特定的酵母内源基因以及外源基因进行基因元件、基因模块的构 建，并转入到敲除8&114&174 &110和7?1062?基因的酵母基因组上，实现重组菌株番茄红 素的合成产量提高。其中，所涉及的酵母内源基因包括截短的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶基因tHMGRl，可通过酵母基因组为模板，通过PCR扩增获得；同时，本专利技术还涉及采用酵母中的氨基酸标记、启动子和终止子，包括CYC1终止 子、GAL10启动子、GAL1启动子、PGK1终止子、ACT1终止子、GPM1终止子、LEU2标记、TDH2终止 子、FBA1终止子、EN02终止子、HIS3标记，上述基因元件的获得也可以酵母基因组为模板，通 过PCR扩增获得； 在本专利技术中，上述各基因元件以及相关的上下游同源序列以酿酒酵母菌株BY4741 的基因组为模板，设计并合成合适的引物，通过PCR扩增得到；而LEU2上游同源序列及LEU2 标记是一并从质粒PRS405上PCR扩增下来，HIS3上游同源序列及HIS3标记是一并从质粒 pRS313(质粒图谱见图11)上PCR扩增下来。本专利技术所涉及的外源基因包括香叶基焦磷酸(GGPP)合酶基因crtE、八氢番茄红素 合成酶基因crtB和八氢番前红素脱氢酶基因crtl。其中crtE的来源为曼地亚红豆杉(Taxus Xmedia)，简写为TmcrtE;crtB的来源为成团泛菌（Pantoeaagglomerans)，简写为Pa crtB;crtI的来源为三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)，简写为Btcrtl。上述基因均 为经过密码子优化并适当规避常用限制性酶切位点后通过人工合成得到。 作为优选，所述菌株还包括经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片 段： 酵母his3位点上游同源序列、HIS3标记、EN02终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA 还原酶基因tHMGRl、GAL10启动子、GAL1启动子、融合基因BTS1-ERG20、FBA1终止子、酵母 his3位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段4(模式图见图4)。进一步优选地，所述基 因片段4如SEQIDNO:4所示。 更优选地，所述菌株还敲除roxl基因。 最优选地，所述菌株还包括经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片 段： 酵母YPRCde1ta15位点上游同源序列、DR-K1URA3 -DR营养标签、CPS1终止子、转录 因子IN02、GAL1启动子、酿酒酵母YPRCdeltal5位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段 5(模式图见图5)。进一步优选地，所述基因片段5如SEQIDN0:5所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组酵母菌株，其特征在于，所述酵母基因组敲除gal1、gal7、gal10和ypl062w基因，且包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：酵母trp1位点上游同源序列、CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、Pa crtB、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段1；酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACT1终止子、截短的HMG‑CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、Tm crtE、GPM1终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2；基因片段2中TDH2终止子及其上游同源序列、DR‑Kl URA3‑DR营养标签、CYC1终止子、Bt crtI、GAL7启动子、基因片段2中ACT1终止子及其下游同源序列顺次拼接而成的基因片段3。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖文海，陈艳，李霞，元英进，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12