本发明专利技术公开了一种亮菌漆酶及其基因，发明专利技术人据此构建了重组毕赤酵母工程菌，使用该工程菌可实现高效发酵获取重组亮菌漆酶。在毕赤酵母异源表达的基础上，发明专利技术人对这个酶蛋白进行纯化和酶学活性研究，结果表明，本发明专利技术的漆酶具有漆酶活性，亮菌漆酶或重组亮菌漆酶能有效催化2，4-二氯苯酚降解，金属铜离子对该漆酶活性有促进作用，而锰离子、锌离子、镁离子、钙离子、银离子和SDS对其活性具有抑制作用。对制备的重组漆酶的稳定性分析显示，该重组漆酶的稳定性很好，而且对酸性环境有较高的耐受性，应用价值巨大。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
和环境生物领域，尤其设及一种亮菌漆酶基因及其重组 毕赤酵母工程菌和应用，具体设及来源于亮菌的真菌漆酶基因。
技术介绍
改革开放30年来，我国的经济和工业得到了前所未有的发展，然而工业发展造成 环境的严重污染已是不争的事实。环境污染已成为经济发展的瓶颈、人类生存的威胁，同时 也成为当前国际关系、经贸合作中一个极为重要的问题，日益严重地影响着我国国民经济 的可持续发展。目前，我国工业尤其是造纸和纺织印染工业的废水对环境的污染十分严重。 研究显示，我国造纸行业年排放废水量达40亿吨，占全国工业废水排放量的1/6,其中有机 污染物（WB0的十)达170万吨，约占全国工业废水中有机污染物总量的1/4。在用植物原料进 行化学制浆与化学漂白过程中，含有大量木质素、半纤维素和有毒有害物质的废液被排入 江、河及湖泊中，造成了严重的环境污染和生态破坏。 造纸工业是广西的特色产业之一。广西是产糖大户，2010年，广西糖料薦种植面积 达1600万亩，甘薦总产量达7119.6万吨，食糖总产量710万吨，糖料薦种植面积和食糖产量 均占全国总量的一半W上，高居全国首位，拥有非常丰富的甘薦渣原料。研究表明，甘薦渣 中纤维素为32%~48%、半纤维素约为19%~24%、木质素约为23%~32%、其它约为4%， 是一种良好的制浆造纸原料。目前，甘薦渣已成为广西造纸的主要原料之一。造纸工业已被 列入广西千亿元产业规划，预计2020年产值达到1200亿。因此，造纸业产生的污染不能忽 视。造纸工业过程中排放的污水中经常含有二嗯英，巧喃和有毒化学物质(如丹宁酸、苯酪、 树脂、脂肪酸等）。据2009年广西污普数据统计，全区工业废水COD排放量约123.6万吨，其中 制浆造纸行业COD排放量约为30.7万吨，占全区工业废水COD排放量的24.8%，是广西主要 的工业污染行业。 能源短缺、环境污染等危机频临，绿色可再生资源利用迫在眉睫。木质纤维素是地 球上含量最丰富的可再生碳水化合物，充分地有效利用木质纤维素降解酶和生物化工将其 转化为液体燃料和化工原料(如乙醇，下醇等），对缓解W上危机具有重大意义。目前，广泛 用于产木质纤维素降解酶的微生物菌株来自木霉属(Trichoderma SP.)，主要包括外切葡 聚糖酶（cellobiohy化olase，CBH，EC 3.2.1.91)、内切葡聚糖酶（endoglucanase，EG，EC 3.2.1.4)、β-葡萄糖巧酶化-glucosidase，B化，EC 3.2.1.21)。纳米级植物显微技术显示纤 维素和半纤维素被坚不可摧的木质素包围，很难直接被纤维素降解酶水解，需要进行预处 理去除或分解木质素。工业上大规模利用化学预处理木质纤维素，既耗能也污染环境。用木 质素降解酶生物预处理是良好的选择。木质素降解酶主要包括木质素过氧化物酶（lignin peroxidases，LiP，EC 1.11.1.14)、车孟过氧化酉每（manganese peroxidases，MnP，EC 1.11.1.13)、漆酶(LacAT，Lac，EC 1.10.3.2)，广泛来源于白腐真菌、褐腐真菌和软腐真菌 (Wong，2009)。研究显示，木质纤维素降解酶和木质素降解酶成本高，产量低，不能满足工业 需求。因此，开发新型高效的产纤维素降解酶和木质素降解酶的微生物资源极为重要。[000引漆酶是单电子氧化还原酶，具有广泛的底物专一性，可氧化的底物包括:酪类及其 衍生物、芳胺及其衍生物、芳香簇酸及其衍生物等，主要应用于工业和化学反应。目前漆酶 的研究内容设及到发酵工程、生物化学、分子生物学及遗传学等多领域，包括菌株的生长特 征、合成调控、分离纯化、催化机制、条件优化、基因克隆表达等方面。研究表明，漆酶可W使 苯氧基类除草剂和石油工业的废水除去毒性，在制浆造纸应用方面已应用于漂白、制浆、脱 墨、废水处理、纤维改性等，如用云芝的粗漆酶液(2474.2lU/mL)对50mg/L的說蓝溶液进行 脱色，作用40min，脱色率达到94.8%。随着研究的深入，漆酶的应用愈加广泛，可用于生物、 化学、物理、医学、食品、环境保护等多个领域，特别是在多种有毒化合物和木质素的降解、 纸浆的生物漂白等多方面发挥着重要作用，能节约设备和能耗，缩短纸浆生产周期，降低生 产成本，将会给造纸工业带来良好的经济效益和社会效益。研究显示，一些白腐真菌漆酶可 W降解木质素，但是需要相应的化合物(称为中介)作为漆酶的作用底物，如黎芦醇、愈创木 酪、ABTS、二甲苯胺、阿魏酸、下香醒、单宁酸、香草酸、香豆酸等，它们在结构上的共同特征 是芳环上通常连有-OH或-N此基团。近年来，大约20多种不同来源的漆酶得到纯化，并对其 性质进行了研究，为漆酶的工业化生产和应用奠定了基础。显然，漆酶是一种具有广阔应用 领域和巨大市场价值的生物酶。 大量的实验研究证明，不同发酵方法对真菌分泌漆酶有很大影响，而且多种漆酶 自身的表达量很低，例如中科院微生物所得到的漆酶高产血红密孔菌菌株P. sanguineus MK528,其摇瓶发酵漆酶单位体积产酶能力为63U/mL，达到国内领先水平。因此，只有在异源 宿主上表达重组漆酶蛋白才是解决运一问题的关键，如白腐菌化lyporus grammocephalus TR16漆酶基因异源表达，其产酶能力达到893.抓/ml。 亮菌（Armillariella tabescens)，学名假密环菌，属白磨科蜜环菌属，因其在黑暗的夜晚可W发出淡蓝色巧光，故得名 亮菌。近年的研究证明亮菌是我国拥有自主知识产权的重要药用真菌，其提取物具有抗福 射、抗乙肝病毒等作用，可治疗肝炎、胆囊炎、胃炎、新生儿高胆红素血症等。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种亮菌漆酶基因及其重组毕赤酵母工程菌和 应用。 为解决上述技术问题，本专利技术采用W下技术方案：亮菌漆酶基因，具有序列表 SEQ. ID. NO. 1的碱基序列或者具有编码序列表SEQ. ID. NO. 2氨基酸序列的碱基序列。 亮菌漆酶为亮菌漆酶基因编码的蛋白质，它具有序列表SEQ. ID.NO. 2的氨基酸序 列。 重组毕赤酵母工程菌，携带含亮菌漆酶基因的表达载体。 上述重组毕赤酵母工程菌的构建方法，将亮菌漆酶基因编码的cDNA连入到毕赤酵 母表达载体PPIC9K，得到重组表达载体pPIC9K-LacAT;再将重组表达载体pPIC9K-LacAT质 粒线性化后电转化至GS115菌株，得到异源重组酵母工程菌GS115-PIC9K-LacAT。 上述重组毕赤酵母工程菌的构建方法，按W下操作进行:取20μ1线性化的单拷贝 质粒分别加入80μ1 GS115感受态细胞并轻轻混匀，转入2mm预冷电转杯，冰上放置5min，放 入电转仪，电击，电压：1500V，电击时间5.2ms，电击完成后，立即加入1ml 1M预冷的山梨醇， 混匀后转移到1.5ml离屯、管中，30°C，静止1-化，每200μ1涂一块含0.5mg/ml G418的MD平板， 30°C，培养2d，形成分散，饱满的单克隆。 上述重组毕赤酵母工程菌用于发酵获取重组亮菌漆酶。 上述亮菌漆酶或重组亮菌漆酶在催化氯酪降解本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种亮菌漆酶基因，其特征在于具有序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列或者具有编码序列表SEQ.ID.NO.2氨基酸序列的碱基序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：詹洁，赵帅，凌庆枝，范业赓，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45
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