本发明专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶基因及其重组载体和工程菌。本发明专利技术提供一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶基因，如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术根据大肠杆菌密码子使用偏爱性，对Metallosphaera hakonensis来源的锰过氧化氢酶基因序列进行密码子优化，当优化后的锰过氧化氢酶在大肠杆菌中表达时，摇瓶发酵液中最高可检测到过氧化氢酶酶活为300U/mL。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢 酶基因及其重组载体和应用。
技术介绍
过氧化氢酶（Catalase，简称CAT)，催化H202分解为Η20和02。各种来源的CAT广 泛应用于食品消毒、医学分析与诊断、纺织、造纸等工业领域。在纺织染整工艺中CAT主要 用于去除织物漂白废液中残余的H202，消除其对后续染色工序的影响。与传统化学工艺相 比，CAT具有环境友好、面料后续印染质量高等优点；但值得注意的是，鉴于纺织印染工艺 的特殊性，CAT的催化反应通常需在高温（T>70°C)碱性（pH>9)环境中进行，这就需要CAT 具备嗜热嗜碱的应用特性。而目前文献报道的嗜热耐碱性CAT仍然较少。 CAT按蛋白三维晶体构象的结构特点可分为两类：（1)催化中心含铁卟啉环结构 的CAT，称铁过氧化氢酶（FeCAT) ; (2)催化中心由锰离子代替铁离子卟啉结构，称为锰过氧 化氢酶（MnCAT)。近年来，研究者发现个别来源于高温碱性环境中的细菌可以产生具有嗜 热嗜碱特性的MnCAT，例如：箱根生金球菌（Metallosphaerahakonensis)来源的MnCAT，在 pH8. 0-10. 0环境中处理60min酶活损失小于20% ;在70°C下处理50min，酶活残留率约在 60% ;但目前Metallosphaerahakonensis来源的MnCAT在大肠杆菌中仅有少量的活性表 达蛋白，且文献中未表述具体的酶活值。
技术实现思路
本专利技术鉴于上述情况，根据大肠杆菌密码子使用偏爱性，对Metallosphaera hakonensis来源的锰过氧化氢酶基因序列进行密码子优化，提供一种嗜热碱性重组含锰过 氧化氢酶基因及其表达载体和重组菌株，用于解决现有技术中的问题。 为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶 的编码基因，其序列如SEQIDNo. 1所示： 所述编码基因根据Metallosphaerahakonensis来源的猛过氧化氢酶基因核苷酸 序列，按照大肠杆菌（Escherichiacoli)密码子使用偏爱性（http://gcua.schoedl.de/seqoverall_v2.html)优化设计。所述Metallosphaerahakonensis来源的猛过氧化氢酶 基因核苷酸序列选自GenBank数据库。 本专利技术第二方面提供包含上述重组嗜热碱性含锰过氧化氢酶基因的重组载体。优 选的，所述重组载体使用的表达载体为PET系列表达载体。 更优选的，所述PET系列表达载体为pET24a(+)，获得包含上述重组嗜热碱性含锰 过氧化氢酶基因的重组载体pET24a-MnCat。将本专利技术的重组嗜热碱性含锰过氧化氢酶基因 插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相 连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，优选将本专利技术的重组嗜热碱性含锰过氧化氢 酶基因插入到质粒pET24a(+)上的NdeI和HindIII限制性酶切位点之间，得到重组表达 载体pET24a-MnCAT，经测序验证后保存在大肠杆菌DH5α中。 本专利技术第三方面提供包含上述嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶基因的重组菌株。 所述重组菌株由所述重组含锰过氧化氢酶表达载体pET24a-MnCAT转化获得。 优选的，所述重组菌株由所述重组嗜热碱性含锰过氧化氢酶表达载体转化大肠杆 菌获得。 更优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21 (DE3)，获得的重组菌株为大肠杆菌 BL21 (DE3)/pET24a-MnCAT〇 本专利技术第四方面提供所述嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶MnCAT，由权利要求1所 述的嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶基因编码。 本专利技术第五方面提供所述嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶的制备方法，包括如下步 骤： 1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶表达； 3)回收并纯化所表达的嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶。 作为优选地，上述的重组嗜热碱性含锰过氧化氢酶的制备方法，包括以下步骤： 将所述重组菌株BL21 (DE3) /pET24a-MnCAT在LB培养基中活化过夜后，转接至TB 培养基中，当菌浓0D600达到2时，添加MnCljPIPTG，再诱导培养，获得重组嗜热碱性含锰 过氧化氢酶。 所得培养液的菌体破碎上清液中的酶活力可达300U/mL。 进一步的，由于载体pET24a(+)上含有6-His纯化标签，因此选择常用的Ni-NTA 树脂亲和层析法进行蛋白纯化。 优选的，转接时按5%转接。 优选的，转接至含有50μg/mlKan的TB培养基中。 优选的，所述IPTG的终浓度为0.08mmol/L，所述此(：12的终浓度10mmol/L。优选 的，所述诱导培养的具体条件为：在37°C条件下诱导24h。 本专利技术还提供了上述嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶基因的应用，尤其是在大肠杆 菌中的高效活性表达Metallosphaera hakonensis来源的含猛过氧化氢酶的应用。Metallosphaerahakonensis来源的MnCAT与专利CN103725699A中表述的 Thermusthermophilus来源的MnCAT相比，其蛋白的氨基酸序列具有约5%的差异；氨基酸 序列的差异引起两种MnCAT三维构象的直接变化，从而导致其酶学性质的差异，例如：来源 于Metallosphaerahakonensis的MnCAT的最佳pH范围为pH8. 0-10.0,在此范围内酶活 力变化平缓，稳定性好;但来源于Thermusthermophilus的MnCAT的最适pH在pH10. 0， 在pH8. 0-10. 0范围内酶活力呈上升趋势，无平缓区间。酶学性质上的明显差异，表明两 种来源MnCAT具有其各自的独特性。 本专利技术根据大肠杆菌密码子使用偏愛性，对Metallosphaerahakonensis来源的 锰过氧化氢酶基因序列进行密码子优化，当优化后的MnCAT在大肠杆菌中表达时，摇瓶发 酵液中最高可检测到CAT酶活为300U/mL，本专利技术通过基因密码子优化及发酵优化实现了 Metallosphaerahakonensis来源的MnCAT在大肠杆菌中的高效活性表达，且其发酵酶活 值达到约300U/mL，为该酶的进一步应用开发奠定了基础。 参考文献 Shinji Ebara,Yasushi Shigemori. Alkali-tolerant high-activity catalase from a the当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李国高，李琦，刘朝阳，李望龙，
申请(专利权)人：湖南利尔康生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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