本发明专利技术公开一种BSMV-VIGS重组载体，为含有目标基因片段、噬菌体f1 ori、抑制因子laci、大肠杆菌E1因子ori、β-内酰胺酶基因bla、T7启动子的病毒RNA，所述目标基因片段为SEQ ID NO.1所示的TaRSR1转录因子mRNA部分cDNA序列；其制备方法包括：TaRSR1转录因子mRNA部分cDNA片段的克隆、BSMV-γ:TaRSR1重组载体的构建、转化；本发明专利技术还公开一种病毒接种混合液，含等体积的BSMV-α、BSMV-β、权利要求2所述BSMV-γ: TaRSR1重组载体；以及该重组载体在小麦增产或育种中的应用。利用本发明专利技术BSMV-VIGS重组载体可在田间自然条件下，建立一种研究小麦产量性状基因功能的有效方法，有利于深入揭示小麦产量性状基因功能的分子机制，以指导小麦的育种工作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业应用生物
，尤其涉及一种BSMV-VIGS重组载体及其在小麦产量性状基因研究中的应用。
技术介绍
病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing,VIGS)系统是近年来发展起来研究基因功能的新方法，它的原理主要是：当携带目标基因cDNA的病毒载体浸染植物细胞后，在植物细胞内复制与表达过程中会形成双链RNA形式的中间体（dsRNA），dsRNA作为基因沉默的激发子，首先在细胞中被特异核酸内切酶切割成小片段的RNA（siRNA），然后siRNA在植物细胞内被RNA聚合酶进一步扩增，并以单链形式与一些特异蛋白（AGO1）等结合形成RNA诱导的沉默复合体，此沉默复合体又特异与胞质中同源RNA互作，造成同源RNA降解导致产生转录后水平的基因沉默。小麦是世界上三大重要粮食作物之一，其中普通小麦（TriticumaestivumL.）产量占全世界小麦总产90%以上。普通小麦是异源六倍体，含有A、B和D三套染色体组，95%以上的基因存在3个或更多拷贝，其基因组非常庞大（17000Mb，分别是水稻和玉米基因组的40倍和7倍），而且结构复杂（85%以上序列为重复序列）；同时，由于小麦基因型的依赖性很强、品种间再生能力差异显著，导致稳定的再生体系尚未建立，成为现今世界上最难转化的作物之一。这些主要因素导致了现今小麦分子机理的研究远落后于基因组较小、转化相对容易的水稻等其它主要农作物。虽然已有一些小麦抗逆基因在拟南芥、烟草和水稻等转化较为容易的植物上进行了功能验证，但对于控制小麦籽粒淀粉、蛋白质等产量性状基因来说，由于物种间产量性状及生长环境的差异性（水稻等属于喜温的秋粮作物，生长在温度较高的夏季；而小麦属于喜凉的越冬作物，大部分时间生长在温度较低的冬季与春季），小麦产量性状基因的功能不适宜在水稻等基因组简单、转化容易的作物上进行。因此，摸索出一种适合研究小麦产量性状基因功能的研究方法，有助于深入揭示小麦产量性状形成的分子机理。VIGS方法克服了遗传转化困难植物基因功能研究方法的局限性，主要有以下优点：（1）VIGS能直接在个体中鉴定基因功能缺失的表型，无需通过耗费较长的时间筛选大量再生植株个体来鉴定转基因植株，可快速鉴定基因功能；（2）它是一种瞬时基因沉默方法，不需要复杂的遗传转化体系；（3）能通过对基因家族中高度保守的序列进行沉默来克服基因功能冗余现象；（4）可快速比较同一基因在不同物种中的功能，以进行比较基因组学研究。上述优点对于遗传转化困难、且基因组庞大而复杂的普通小麦来说，非常适用，因此，VIGS已在小麦基因功能研究上开始应用。但现今国内外运用VIGS方法研究小麦基因的功能均在实验室培养箱内或温室内等易控条件下（人工可设定的温度、湿度、光照等可控的生长条件）进行小麦抗逆基因的功能研究。但培养箱或温室可控条件下与田间多变条件下的小麦植株的生长状况有一定差异。如培养箱或温室中小麦植株生长发育表现出分蘖率较差、生育期缩短、生育后期植株早衰、千粒重较低、产量显著低于田间生长的小麦植株等现象，导致在培养箱或温室环境下利用VIGS方法研究小麦基因功能、特别是产量性状基因的功能有一定局限性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种BSMV-VIGS重组载体，利用该载体可在田间自然条件下，建立一种研究小麦产量性状基因功能的有效方法，有利于深入揭示小麦产量性状基因功能的分子机制，以指导小麦的育种工作。本专利技术的研究思路为：利用大麦条纹花叶病毒（barleystripemosaicvirus,BSMV）重组构建含有α、β和γ三条不同的单链RNA的BSMV载体系统（如图1所示）。分别将上述三条链的RNA反转录合成cDNA后，克隆到对应的pBSMV载体上。该载体包含有T7启动子和转录原点，可通过T7RNA聚合酶以线性化BSMV载体为模板体外进行转录，获得病毒RNA，用转录得到的3条链的RNA转录本等量摩擦接种植物后，病毒RNA在植物体内能形成具有活性的基因组，进行增殖传播。在γb之后有一个NheI酶切位点，可将目标基因片段通过分子克隆构建到BSMV-γ载体上，目标基因片段可以随着病毒自身基因组的复制而得到复制，并通过转录后水平沉默目标基因。为完成上述目的，本专利技术采用以下技术方案来实现的：构建了一种BSMV-γ:TaRSR1重组载体，其为含有目标基因片段、噬菌体f1ori、抑制因子laci、大肠杆菌E1因子ori、β-内酰胺酶基因bla、T7启动子的病毒RNA，所述目标基因片段为SEQIDNO.1所示的TaRSR1转录因子mRNA部分cDNA序列。上述重组载体的制备方法，包括以下步骤：（1）TaRSR1转录因子mRNA部分cDNA片段的克隆提取小麦籽粒的总RNA，并通过反转录获得与小麦总RNA对应的cDNA，取所得cDNA作为模板，通过PCR扩增TaRSR1转录因子片段序列，用所得扩增产物进行电泳检测、切胶回收，将回收所得扩增产物连接至pMD18-Tsimple载体，再转化大肠杆菌DH5α，然后，挑取验证过的阳性单克隆，进行测序鉴定；（2）BSMV-γ:TaRSR1重组载体的构建、转化与筛选取测序正确的TaRSR1-pMD18-Tsimple质粒与BSMV-γ:GFP质粒分别用限制性内切酶NheI单酶切，再进行电泳检测、切胶回收，分别得到纯化的TaRSR1基因片段和BSMV-γ质粒；用T4-DNA连接酶将纯化后的TaRSR1基因片段连接至纯化后的BSMV-γ质粒，得到BSMV-γ:TaRSR1重组载体，再将其转化至感受态大肠杆菌JM109，涂布在LB平板培养基上，LB平板培养基经37℃过夜培养长出单菌落，将所得单菌落依次进行PCR验证、重组质粒酶切验证和测序鉴定，挑选阳性菌落，得BSMV-γ:TaRSR1重组载体。由等体积的BSMV-α、BSMV-β、及上述BSMV-γ:TaRSR1，加入DEPCwater和2×GKPbuffer等混合均匀后，制成各载体浓度为500μg/ml的病毒接种混合液，可用小麦产量性状基因功能的研究，用于指导小麦育种工作，也可直接将其用于小麦增产。上述病毒接种混合液的制备方法，包括以下步骤：（1）BSMV载体线性化用限制性内切酶MluI分别单酶切BSMV-α质粒和权利要求2所得BSMV-γ:TaRSR1重组质粒，使其线性化；用限制性内切酶SpeI单酶切BSMV-β质粒，使其线性化；（2）体外转录生产病毒取所得线性化BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ:TaRSR1载体DNA分别进行体外转录、检测和保存；（3）病毒接种混合液的制备取等体积的BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ:TaRSR1，与9倍于BSMV-α体积的DEPCwater和12倍于BSMV-α体积的2×GKPbuffer混合均匀，即成。田间自然条件下研究小麦产量性状基因功能的方法，包括以下步骤：于小麦抽穗期，在田间创造一个高湿（湿度85%以上）、黄昏弱光、18～22℃低温的环境，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种BSMV‑VIGS重组载体，为含有目标基因片段、噬菌体f1 ori、抑制因子laci、大肠杆菌E1因子ori、β‑内酰胺酶基因bla、T7启动子的病毒RNA，其特征在于：所述目标基因片段为SEQ ID NO.1所示的TaRSR1转录因子mRNA部分cDNA序列。
【技术特征摘要】
1.一种BSMV-VIGS重组载体，为含有目标基因片段、噬菌体f1ori、抑制因子laci、大肠杆菌E1因子ori、β-内酰胺酶基因bla、T7启动子的病毒RNA，其特征在于：所述目标基因片段为SEQIDNO.1所示的TaRSR1转录因子mRNA部分cDNA序列。
2.权利要求1所述BSMV-VIGS重组载体的制备方法，包括以下步骤：
（1）TaRSR1转录因子mRNA部分cDNA片段的克隆
提取小麦籽粒的总RNA，并通过反转录获得与小麦总RNA对应的cDNA，取所得cDNA作为模板，通过PCR扩增TaRSR1转录因子片段序列，将回收所得扩增产物连接至pMD18-Tsimple载体，再转化大肠杆菌DH5α，然后，挑取验证过的阳性单克隆，进行测序鉴定；
（2）BSMV-γ:TaRSR1重组载体的构建、转化
取测序正确的TaRSR1-pMD18-Tsimple质粒与BSMV-γ:GFP质粒分别用限制性内切酶NheI单酶切，再进行电泳检测、切胶回收，分别得到纯化的TaRSR1基因片段和BSMV-γ质粒；
用T4-DNA连接酶将纯化后的TaRSR1基因片段连接至纯化后的BSMV-γ质粒，得到BSMV-γ:TaRSR1重组载体，再将其转化至感受态大肠杆菌JM109，涂布在LB平板培养基上，LB平板培养基经37℃过夜培养长出单菌落，将所得单菌落依次进行PCR验证、重组质粒酶切验证和测序鉴定，挑选阳性菌落，得BSMV-γ:TaRSR1重组载体。
3.一种病毒接种混合液，含等体积的BSMV-α、BSMV-β、权利要求2...
【专利技术属性】
技术研发人员：康国章，刘国玉，郭天财，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
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