【技术实现步骤摘要】
相关申请的交叉引用本申请要求2007年12月11日由TravisYoung提交的美国临时专利申请序列号61/007,341的优先权和权益，其名为“甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达(INVIVOUNNATURALAMINOACIDEXPRESSIONINTHEMETHYLOTROPHICYEASTPICHIAPASTORIS)”，该申请的内容出于所有目的通过引用全文纳入本文。对于联邦政府资助研发下作出专利技术的权利声明本专利技术是在美国能源部，材料科学部位的基金号DE-FG03-00ER46051的美国政府支持下作出。美国政府对本专利技术享有一定权利。专利
本专利技术涉及蛋白质化学领域，例如，翻译生物化学。本专利技术涉及在甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中产生包含非天然氨基酸的多肽的组合物和方法。专利技术背景借助异源正交tRNA/氨酰tRNA合成酶配对(O-tRNA/O-RS配对)可将非天然氨基酸高...
【技术保护点】
一种甲基营养酵母细胞，其包含：a)非天然氨基酸；b)正交氨酰‑tRNA合成酶(O‑RS)，其中所述O‑RS在甲基营养酵母细胞中优先用非天然氨基酸氨酰化正交tRNA(O‑tRNA)，并且，所述O‑RS由整合入基因组的核酸在FLD1启动子的转录调控下表达，该核酸包含编码所述O‑RS的多核苷酸；和c)正交tRNA(O‑tRNA)，其中所述O‑tRNA在甲基营养酵母细胞中识别选择者密码子并优先被所述O‑RS用非天然氨基酸氨酰化，并且，所述O‑tRNA由整合入基因组的核酸表达，所述O‑RS和所述O‑tRNA由同一质粒上的表达盒编码且稳定整合到细胞基因组的ARG4基因，该核酸包含编码或...
【技术特征摘要】
2007.12.11 US 61/007,3411.一种甲基营养酵母细胞，其包含：
a)非天然氨基酸；
b)正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，其中所述O-RS在甲基营养酵母细胞中优先用非天然
氨基酸氨酰化正交tRNA(O-tRNA)，并且，所述O-RS由整合入基因组的核酸在FLD1启动子的
转录调控下表达，该核酸包含编码所述O-RS的多核苷酸；和
c)正交tRNA(O-tRNA)，其中所述O-tRNA在甲基营养酵母细胞中识别选择者密码子并优
先被所述O-RS用非天然氨基酸氨酰化，并且，所述O-tRNA由整合入基因组的核酸表达，所述
O-RS和所述O-tRNA由同一质粒上的表达盒编码且稳定整合到细胞基因组的ARG4基因，该核
酸包含编码或包含所述O-tRNA的多核苷酸；并且
所述O-RS和O-tRNA衍生自大肠杆菌。
2.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述非天然氨基酸包括：对-(炔丙基氧基)苯
丙氨酸、对-甲氧基苯丙氨酸、丹酰基丙氨酸、DMNB-丝氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘
基)丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、O-炔丙基-L-酪氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-
苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷
酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-氨基-L-苯
丙氨酸、酪氨酸的非天然类似物；谷氨酰胺的非天然类似物；苯丙氨酸的非天然类似物；丝
氨酸的非天然类似物；苏氨酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰
肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸盐、硼化物、磷、膦酰基、膦、杂
环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮或氨基取代的氨基酸，或其任何组合；带有光活化交联剂的氨基
酸；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；带有新型官能团的氨基酸；与另一分子共价或非共价
相互作用的氨基酸；结合金属的氨基酸；含金属的氨基酸；放射性氨基酸；光束缚的和/或光
敏异构化的氨基酸；含生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化或糖修饰的氨基酸；含酮氨
基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学裂解或可光裂解的氨基
酸；带有延长侧链的氨基酸；含有毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸例如糖取代的丝氨酸
等；含碳连接的糖的氨基酸；糖取代的半胱氨酸；具有氧化还原活性的氨基酸；含α-羟基的
酸；含氨基硫代酸的氨基酸；α,α二取代氨基酸；β-氨基酸；硫代酪氨酸；4-溴苯丙氨酸；或脯
氨酸之外的环状氨基酸。
3.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，从高水平的组成型启动子表达所述O-tRNA。
4.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述启动子包括PGK1启动子。
5.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述细胞包含含有编码感兴趣多肽的多核苷
酸的核酸，其中所述多核苷酸包含所述O-tRNA所识别的选择者密码子。
6.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述感兴趣多肽包括HSA、人中性肽链内切酶
(NEP)、抗体、Fab、Fv、α-1抗胰蛋白酶、血管抑制素、抗溶血因子、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心
房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、
gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单
核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单
核细胞炎性蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、
CD40配体、c-kit配体、胶原酶、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制物、补体受体1、
细胞因子、上皮细胞中性白细胞激活肽-78、GROα、MGSA、GROβ、GROγ、MIP1-α、MIP1-β、MCP-
1、人表皮生长因子(hEGF)、上皮细胞嗜中性白细胞激活肽、促红细胞生成素(EPO)、剥落性
毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、FGF21、血纤蛋白原、
纤连蛋白、G-CSF、GM-CSF、人葡糖脑苷脂酶、促性腺激素变体、生长因子、生长因子受体、
hedgehog蛋白、血红蛋白、肝细胞生长因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白(HSA)、ICAM-1、
ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、人胰岛素、人胰岛素-样生长因子(hIGF)、hIGF-I、hIGF-II、
人干扰素、IFN-α、IFN-、IFN-γ、白介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-
9、IL-10、IL-11、IL-12、角化细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神
经营养因子、嗜中性白细胞抑制因子(NIF)、人抑瘤素M(OSM)、成骨蛋白、癌基因产物、甲状
旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、人生长激素(hGH)、多效生长因子、A蛋白、G蛋白、致热外
毒素A、致热外毒素B、致热外毒素C、松弛素、肾素、SCF/c-kit、可溶性补体受体I、可溶性I-
CAM1、可溶性白介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗
原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化
酶、中毒性休克综合征毒素、胸腺素α1、组织纤溶酶原激活物、肿瘤生长因子(TGF)、TGF-α、
TGF-β、人肿瘤坏死因子(hTNF)、人肿瘤坏死因子α、人肿瘤坏死因子β、人肿瘤坏死因子受体
(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、人血管内皮生长因子(hVEGEF)、hVEGF165、尿激酶、Mos、
Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受体、孕酮受体、睾酮受体、醛固酮受
体、LDL受体、炎性分子、信号转导分子、转录激活物、转录抑制物、透明质酸酶、CD44、皮质
酮、人甲状腺过氧化物酶(hTPO)、破伤风毒素片段C、牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(BPTI)、人淀粉
样前蛋白(APP)、人抗凝血酶III、BP320抗原、人胱冬酶-3、乙型肝炎表面抗原、人性别类固
醇结合蛋白(hSBP)、人内皮抑制素或gp120。
7.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述核酸整合入基因组。
8.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述核酸以单拷贝整合入基因组。
9.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述整合由编码非必需基因的基因座处的基
因替代介导。
10.如权利要求9所述的细胞，其特征在于，所述非必需基因是AOX1。
11.如权利要求10所述的细胞，其特征在于，所述细胞显示甲醇利用表型，其中所述甲
醇利用表型是mutS。
12.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述核酸以多拷贝整合入基因组。
13.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述细胞显示甲醇利用表型，其中所述甲醇
利用表型是Mut+。
14.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，从诱导型启动子表达所述感兴趣多肽。
15.如权利要求14所述的细胞，其特征在于，所述诱导型启动子包括：AOX1启动子、AOX2
启动子、ICL1启动子或FLD1启动子。
16.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，从组成型启动子表达所述感兴趣多肽。
17.如权利要求16所述的细胞，其特征在于，所述组成型启动子是YPT1启动子或GAP启
动子。
18.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述甲基营养酵母细胞是假丝酵母属细胞、
汉森酵母属细胞、球拟酵母菌属细胞或毕赤酵母属细胞。
19.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述甲基营养酵母细胞是巴斯德毕赤酵母
细胞。
20.一种在甲基营养酵母细胞中产生在所选位置包含非天然氨基酸的感兴趣多肽的方
法，该方法包括：
a)提供甲基营养酵母细胞，该细胞含有：
i)非天然氨基酸；
ii)正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，其中所述O-RS在甲基营养酵母中优先用非天然氨基
酸氨酰化正交tRNA(O-tRNA)，所述提供O-RS包括将O-RS多核苷酸整合入细胞的基因组并表
达所编码的O-RS，其中该O-RS多核苷酸编码启动子下游的O-RS，所述启动子为FLD1启动子，
所述O-RS和所述O-tRNA由同一质粒上的表达盒编码且稳定整合到细胞基因组的ARG4基因，
并且，所述O-RS和O-tRNA衍生自大肠杆菌；和
iii)正交tRNA(O-tRNA)，其中所述O-RS优先用非天然氨基酸氨酰化所述O-tRNA，所述
O-tRNA多核苷酸整合入基因组；和
iv)编码感兴趣多肽的感兴趣核酸，其中所述感兴趣的核酸包含所述O-tRNA识别的至
少一个选择者密码子；和
b)在感兴趣多肽的翻译期间对选择者密码子起反应而将非天然氨基酸掺入感兴趣核
酸的所选位置，从而产生在所选位置包含非天然氨基酸的感兴趣多肽。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：T·杨，P·G·舒尔茨，
申请(专利权)人：斯克利普斯研究院，
类型：发明
国别省市：美国;US
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