一种减少多糖积累强化光滑球拟酵母生产丙酮酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种减少多糖积累强化光滑球拟酵母生产丙酮酸的方法，属于发酵工程技术领域。本发明专利技术通过在光滑球拟酵母菌株中敲除掉多糖合成相关基因CAGL0H02695g和CAGL0K10626g，获得了一株高产丙酮酸的工程菌株TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g:ARG8；CAGL0K10626g:URA3)，相对于对照菌T.glabrata，其丙酮酸的产量、丙酮酸生产强度和底物转化率分别提高了12.8％、13.6％和34.8％，而细胞干重、葡萄糖消耗速率和副产物多糖分别降低了12.5％、17.9％和16.6％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种减少多糖积累强化光滑球拟酵母生产丙酮酸的方法，属于发酵工程

技术介绍
丙酮酸(pyruvate)是生物代谢的中间产物，处于各代谢途径的中间环节，如：是糖酵解的终产物；通过脱氢脱羧反应转化为TCA循环的起始物质乙酰-CoA；在丙酮酸羧化酶作用下生成TCA循环的中间产物草酰乙酸；通过转氨基作用生成丙氨酸等，同时也是非常重要的酮酸之一。由于丙酮酸是多种物质的合成前体，如多巴胺，丙酮酸乙酯等，目前社会对丙酮酸的需求量日益增加，其广泛的应用于日化，食品，医疗，农业等行业。丙酮酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法两大类。化学合成法主要有酒石酸法、乳酸乙酯空气氧化法、羟基丙酮法、电化学合成法、乳酸催化氧化法。化工合成存在污染大、能耗大、反应条件苛刻的诸多缺点。目前丙酮酸的生产正在由化工合成向微生物发酵转化。微生物发酵法相对于化工合成有更多的优点，如原料的转化率高、污染小、成本低等优点。目前，微生物发酵法生产丙酮酸作为一种替代性的绿色环保方法成为了国内外研究的热门。而要通过微生物发酵获得高产丙酮酸，其中最关键是要有一株高产并且高生产强度的丙酮酸菌株。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种通过敲除多糖合成途径的基因以增强丙酮酸产量和生产强度的方法。本专利技术的第一个目的是提供一种丙酮酸产量和生产强度提高的重组菌，所述重组菌缺失CAGL0H02695g和CAGL0K10626g基因，多糖合成途径被弱化的重组光滑球拟酵母。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌，是以缺失了URA3和ARG8基因的T.glabrataCCTCCM202019为宿主，采用同源重组的方式敲除了SEQIDNO.1所示的基因CAGL0H02695g和SEQIDNO.2所示的基因CAGL0K10626g。本专利技术的第二个目的是提供所述重组菌的构建方法，其步骤为：(1)扩增目的基因CAGL0H02695g在基因组所在位置上下游各600bp的序列CAGL0HL和CAGL0HR，将CAGL0HL和CAGL0HR及序列如SEQIDNO.3所示的ARG8基因融合，构建CAGL0H02695g基因敲除组件CAGL0HL-ARG8-CAGL0HR；(2)扩增目的基因CAGL0K10626g在基因组的上下游各600bp的序列CAGL0KL和CAGL0KR，将CAGL0KL和CAGL0KR及序列如SEQIDNO.4所示的URA3基因融合，构建CAGL0K02695g基因敲除组件CAGL0KL-URA3-CAGL0KR；(3)将CAGL0HL-ARG8-CAGL0HR和CAGL0KL-URA3-CAGL0KR分别与T载连接，将连接后的片段进行测序，将测序正确的基因敲除框分别转化至尿嘧啶缺陷性和精氨酸缺陷性的受体菌中。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：(1)扩增目的基因CAGL0H02695g在基因组中所在位置上下游各600bp的序列CAGL0HL和CAGL0HR，扩增ARG8基因，通过融合PCR将其三个片段连接并获得CAGL0HL-ARG8-CAGL0HR，将其连接到T载上进行测序和保藏；将测序正确的上述敲除框CAGL0HL-ARG8-CAGL0HR转化至尿嘧啶缺陷性和精氨酸缺陷性的受体菌中，在不含尿嘧啶但含有精氨酸的培养基中进行筛选，得到多糖合成基因CAGL0H02695g缺陷的菌株TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g::ARG8)；(2)从目的基因CAGL0K10626g在基因组的上下游分别扩增600bp的序列CAGL0KL和CAGL0KR，并扩增URA3基因，通过融合PCR连接三个片段构建CAGL0K10626g敲除框CAGL0KL-URA3-CAGL0KR，将其连接到T载上进行测序和保藏，(3)将测序正确的CAGL0K10626g敲除框CAGL0KL-URA3-CAGL0KR转化到TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g::ARG8)中，在不含有尿嘧啶和精氨酸的平板上进行筛选，得到多糖合成基因CAGL0H02695g和CAGL0K10626g双缺陷性的菌株TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g::ARG8；CAGL0K10626g::URA3)。本专利技术的第三个目的是提供一种提高丙酮酸产量和生产强度的方法，所述方法是在产丙酮酸的菌株中敲除多糖合成相关的基因；所述多糖合成相关的基因包括SEQIDNO.1所示基因CAGL0H02695g和SEQIDNO.2所示的基因CAGL0K10626g。在本专利技术的一种实施方式中，所述产丙酮酸的菌株是缺失了URA3基因和ARG8基因的光滑球拟酵母T.glabrataCCTCCM202019。本专利技术的第四个目的是提供一种利用所述重组菌发酵生产丙酮酸的方法，是将重组菌活化后接种至发酵培养基，在30℃，200～220rpm条件下进行发酵培养。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基每L含有：葡萄糖50-120g，尿素0-5g，MgSO4.7H2O0-1g，KH2PO40-5g，CH3COONa0-5g，微量元素液10ml，维生素液10ml；所述微量元素液每L含有：MnCl2·4H2O0-12g，FeSO4·7H2O0-2g，CaCl2·2H2O0-2g，CuSO4·5H2O0-2g，ZnCl20-0.1g；所述维生素液每L含有：生物素0-0.01g，硫胺素0-2mg，吡哆醇0-0.2g，烟酸0-2g。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基成分为：葡萄糖50-120g/L，尿素0-5g/L，MgSO4.7H2O0-1g/L，KH2PO40-5g/L，CH3COONa0-5g/L，微量元素液10ml，维生素液10ml，初始pH＝5.5。在本专利技术的一种实施方式中，所述微量元素液配方为：将MnCl2·4H2O0-12g，FeSO4·7H2O0-2g，CaCl2·2H2O0-2g，CuSO4·5H2O0-2g，和ZnCl20-0.1g用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。在本专利技术的一种实施方式中，所述维生素液配方为：将生物素0-0.01g，硫胺素0-2mg，吡哆醇0-0.2g，烟酸0-2g用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。在本专利技术的一种实施方式中，所述接种的接种量按体积比为5-10％。本专利技术的第五个目的是提供所述菌在食品、化工、医药、农业领域生产含丙酮酸的产品中的应用。本专利技术还提供所述方法在生产丙酮酸及其上下游产品方面的应用。有益效果：本专利技术方法可提高丙酮酸产量和生产强度，相对于对照菌株T.glabrataCCTCCM202019，本专利技术构建的重组菌株TGΔarg8Δura3(CAGL0H02695g::ARG8；CAGL0K10626g::URA3)丙酮酸的产量、丙酮酸生产强度和底物转化率分别提高了12.8％、13.6％和34.8％，而细胞干重、葡萄糖消耗速率和副产物多糖分别降低了12.5％、17.9％和16.6％。具体实施方式菌株和质粒：光滑球拟酵母(TGΔarg8Δura3)为在T.glabrataCCTCCM202019的基础上敲除了URA3和ARG8基因的缺陷型菌株，是具有烟酸、生物素、硫胺素、盐酸吡哆醇，尿嘧啶和精氨酸6种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丙酮酸产量和生产强度提高的重组菌，其特征在于，所述重组菌是缺失CAGL0H02695g和CAGL0K10626g基因，多糖合成途径被弱化的重组光滑球拟酵母。

【技术特征摘要】
1.一种丙酮酸产量和生产强度提高的重组菌，其特征在于，所述重组菌是缺失CAGL0H02695g和CAGL0K10626g基因，多糖合成途径被弱化的重组光滑球拟酵母。2.根据权利要求1所述重组菌，其特征在于，以缺失了URA3和ARG8基因的T.glabrataCCTCCM202019为宿主，采用同源重组的方式敲除了SEQIDNO.1所示基因CAGL0H02695g和SEQIDNO.2所示基因CAGL0K10626g。3.权利要求2所述的重组菌的构建方法，其特征在于，以缺失了URA3和ARG8基因的T.glabrataCCTCCM202019为出发菌株，采用同源重组的方式敲除了SEQIDNO.1所示的基因CAGL0H02695g和SEQIDNO.2所示的基因CAGL0K10626g。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤为：(1)扩增目的基因CAGL0H02695g在基因组所在位置上下游各600bp的序列CAGL0HL和CAGL0HR，将CAGL0HL和CAGL0HR及序列如SEQIDNO.3所示的ARG8基因融合，构建CAGL0H02695g基因敲除组件CAGL0HL-ARG8-CAGL0HR；(2)扩增目的基因CAGL0K10626g在基因组的上下游各600bp的序列CAGL0KL和CAGL0KR，将CAGL0KL和CAGL0KR及序列如SEQIDNO.4所示的URA3基因融合，构建CAGL0K02695g基因敲除组件CAGL0KL-URA3-CAGL0KR；(3)将CAGL0HL-ARG...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，罗正山，堵国成，刘松，方芳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32