乳酸生产率提高的微生物和使用其生产乳酸的方法技术

本发明专利技术涉及酵母菌属的产乳酸微生物，其丙酮酸脱羧酶(PDC)活性降低且醛脱氢酶(ALD)和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性提高，以及通过培养该微生物由该微生物培养基生产乳酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及产乳酸重组酵母菌属(Saccharomycessp.)微生物，以及通过培养其由含微生物的培养基生产乳酸的方法。
技术介绍
一般来说，乳酸是具有包括食品添加剂如食品防腐剂、香精、或酸化剂等广泛应用的重要有机酸，并已广泛用于工业目的，如化妆品工业、化学工业、五金工业、电子工业、纺织工业、染色纺织品工业和制药工业等。另外，乳酸是聚乳酸的必需成分，聚乳酸是生物可降解塑料之一，因此，对乳酸的需求已显著提高。其也用作生产很多化合物的重要原料，化合物包括聚乳酸、乙醛、聚丙二醇、丙烯酸、2,3-五硫酮等。特别地，D型乳酸是用于生产立构复合物PLA的必需成分，该立构复合物PLA是生产高耐热PLA的必需光学异构体。特别地，用于生产乳酸的方法包括传统化学合成法和生物发酵法。当经由化学合成法生产乳酸时，乳酸以外消旋混合物的形式生产，该外消旋混合物由50％的D型乳酸和50％的L型乳酸构成，控制该组成比例是困难的，因此，由此生产的聚乳酸可以变为具有低熔点的无定形聚合物，从而对发展其使用施加限制。在另一方面，根据所用的菌株，生物发酵法能够选择性地生产D型乳酸或L型乳酸。因此，由于后者可以生产特定异构体的乳酸，其在商业上是优选的。同时，通过引入用于转化为D型乳酸的酶的基因，已做出尝试经由使用具有D型乳酸生产能力的酵母菌属微生物的各种基因操作以提高乳酸生产率。具体来说，已做出尝试通过加强乳酸脱氢酶(LDH)活性同时降低丙酮酸脱羧酶(PDC)活性、醛脱氢酶(ALD)活性和/或乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性以提高乳酸生产率(美国专利申请公开第2012-021421号，第2010-0248233号和第2006-0148050号)。然而，由于产乳酸菌株的低细胞生长，总发酵生产率是低的。专利技术详述技术问题因此，本专利技术人做出许多努力以获得乳酸生产率提高和有效细胞生长同时PDC活性降低的微生物。结果是，已确认其中PDC同种型活性被控制、醛脱氢酶活性和乙酰辅酶A活性提高的菌株能够提高乳酸产量，促进菌株的细胞生长，从而提高整体的乳酸发酵生产率，这使得本专利技术得以完成。技术手段本专利技术的一个目的是提供乳酸生产率提高的酵母菌属微生物。本专利技术的另一个目的是提供使用酵母菌属微生物生产乳酸的方法。专利技术效果本专利技术涉及通过控制PDC同种型活性、提高醛脱氢酶(ALD)活性和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性、使用乳酸发酵生产率提高的微生物。因此，其可以广泛用于乳酸发酵生产工业。附图说明图1是示出酵母菌属微生物的乳酸生产途径、醇发酵途径和乙酰辅酶A生产途径之间关系的示意图。专利技术最佳技术方案在本专利技术的第一方面，为了实现上述目的，提供了乳酸生产率提高的酵母菌属微生物，其中该微生物是突变的，使得(a)丙酮酸脱羧酶活性相比非突变产乳酸菌株降低；(b)醛脱氢酶活性和乙酰辅酶A合成酶活性相比非突变产乳酸菌株提高。一般来说，产乳酸酵母菌属微生物经由乳酸脱氢酶(LDH)利用丙酮酸作为底物而生产乳酸。使用丙酮酸作为普通底物的代表性代谢途径，醇发酵途径和乙酰辅酶A生产途径被阻断。降低PDC活性对乳酸生产和其产率提高可能是有用的，然而，当降低水平达到一定水平时，产生了不足量的胞质乙酰辅酶A，其反过来阻断细胞生长，因此不能实现正常发酵。因此，本专利技术人通过提高整体的乳酸发酵生产率开发了乳酸生产率提高的酵母菌属微生物，其中通过将乙酰辅酶A途径调节在最低水平而维持微生物的生长率并提高乳酸产量。本文使用的术语“丙酮酸脱羧酶(PDC)”指具有能够介导从丙酮酸制备碳酸和乙醛反应的活性的蛋白质，但并不限于其任何衍生物或具有相同活性的同种型。已经知道该蛋白质涉及醇发酵步骤，大多存在于酵母和植物中。本专利技术的丙酮酸脱羧酶可以固有存在于酵母菌属微生物中，或可以是PDC1、PDC5和/或PDC6，或特别地酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的PDC1、PDC5和/或PDC6，但不限于此。该蛋白质可以包括其任何变体或类似物，只要其是生物学相同的且具有与该蛋白质的相当活性。该蛋白质的氨基酸序列可以从已知数据库等获得，例如NCBI的GenBank等，但不限于此。特别地，PDC1可以由SEQIDNO.71的氨基酸序列构成，PDC5可以由SEQIDNO.72的氨基酸序列构成，PDC6可以由SEQIDNO.73的氨基酸序列构成。该蛋白质可以包括具有与上列氨基酸序列中的每一个大于70％、特别地大于80％、更特别地大于90％、甚至更特别地大于95％同源性的氨基酸序列。由基因密码子简并引起的、编码相同氨基酸序列的上列序列的任何变体也可以包括在本专利技术中。本文使用的术语“同源性”指多个核苷酸序列或氨基酸序列之间的相似性，是代表具有与本专利技术氨基酸序列或核苷酸序列相同序列的序列的单元，具有等于或大于上述可能性的可能性。这种同源性可以通过用肉眼比对两种给定序列确定，更确切地说，其可以使用序列比对程序测定，该序列比对程序是容易得到的，其通过将待比对序列并排排列以解释同源性程度。本领域已知的序列比对程序包括FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST和包含CLUSTALW的软件等。关于通过允许PDC1缺陷而生产乳酸已报道了大量实例，PDC1显示乳酸生产中的主要活性(ApplMicrobiolBiotechnol.2009,82(5):883-90)。在这种情况下，因为PDC6很少被表达，实际的PDC活性看起来是由于PDC5基因的表达。根据报道，单独的PDC1缺陷不会阻碍野生型菌株的细胞生长，相比野生型约60％至70％的PDC活性可以保留，因此在菌株中并没有观察到明显的表型变化(JBacteriol.1990,172(2):678-685)。作为替代方案，可以制备具有PDC1和PDC5基因同时双缺陷的菌株，PDC1和PDC5基因在酵母中显示主要的PDC活性。在这种情况下，在缺乏共底物例如乙酸或醇时可以使用糖源例如糖原实施乳酸发酵。然而，由于PDC活性的快速降低，导致酵母菌株生长速度降低，因而降低了乳酸发酵生产率(BiosciBiotechnolBiochem.2006,70(5):1148-1153)。同时，为了经由与PDC竞争丙酮酸的LDH途径最大化乳酸，可以制备具有PDC1、PDC5和PDC6同时三重缺陷的菌株。在这种情况下，可以最大化乳酸发酵产量，但是由于在葡萄糖存在下诱导的分解代谢物抑制，乙醇和乙酸的代谢能力也可以被抑制，因而降低了细胞生长，最终导致发酵生产率降低(CurrGenet.2003/43(3)/139-160)。特别地，本专利技术的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性降低可以i)使PDC1活性失活，降低PDC5活性；或ii)降低PDC1活性，使PDC5活性失活。在本专利技术的示例性实施方案中，基于其中PDC1活性被灭活的酿酒酵母菌株制备了四种菌株，其包括通过替代PDC5基因启动子而降低PDC5活性的菌株、通过恢复PDC1活性而导致PDC5基因缺陷的菌株、导致PDC1和PDC5基因双重缺陷的菌株和导致PDC1、PDC5和PDC6基因三重缺陷的菌株。在因此制备的菌株中，具有三重基因缺陷的菌株表现出很少经历细胞生长。本文使用的术语“醛脱氢酶(ALD)”指具有从乙醛主要制备乙酸的活性的蛋白质，作本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳酸生产率提高的分离酿酒酵母微生物，其中所述微生物是经修饰的，使得：a)相比未经修饰的产乳酸菌株，所述微生物的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性降低；b)相比未经修饰的产乳酸菌株，所述微生物的醛脱氢酶(ALD)和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性提高。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.09 KR 10-2014-00558651.一种乳酸生产率提高的分离酿酒酵母微生物，其中所述微生物是经修饰的，使得：a)相比未经修饰的产乳酸菌株，所述微生物的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性降低；b)相比未经修饰的产乳酸菌株，所述微生物的醛脱氢酶(ALD)和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性提高。2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述丙酮酸脱羧酶选自PDC1、PDC5和PDC6中的至少一种。3.根据权利要求2所述的微生物，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁殷彬，李泰熙，金善慧，宋规显，河哲雄，罗景洙，梁荣烈，姜玟先，李孝炯，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR