一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法技术

一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术为一种选育大片段缺失的无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的系统方法，主要包括融合ＰＣＲ方法得到大片段缺失的同源重组片段，高效率酵母电转化感受态的制备，制霉菌素富集和限制性培养基筛选。通过一整套系统方法，可以在３－５天内快速的得到目的营养缺陷型菌株。大片段的缺失，有效的避免了回复突变和与外源质粒的同源重组。此外，由于在整个过程中未使用任何抗性标记，使用该方法还可以在同一出发菌株上使用多次，得到多重营养缺陷型，供后续基因工程研究使用。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法，其特征是有机的结合了融合ＰＣＲ技术，酵母高效率感受态制备及转化技术，制霉菌素富集技术及限制性培养基筛选技术；　　　　（１）融合ＰＣＲ技术：　　　　根据融合ＰＣＲ技术，使用４条引物，使用ｐｆｕ高保真ＤＮＡ聚合酶从基因组上ＰＣＲ得到待敲除基因的左右两臂，再进一步进行融合ＰＣＲ将左右臂连接起来；　　　　（２）酵母高效率感受态制备及转化技术：　　　　ａ）挑单菌落接种于５ｍＬ　　ＹＰＤ培养基中，３０℃过夜培养至饱和；　　　　ｂ）０．１％接种至１００ｍＬ　　ＹＰＤ培养基中，３０℃培养１０ｈ，细胞密度为１×１０↑［８］细胞／ｍＬ；　　　　ｃ）培养物分装至两个５０ｍＬ预冷的无菌离心管中，５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ离心去上清，每管加入８ｍＬ无菌水重悬，合并成一管；　　　　ｄ）加入２ｍＬ　　ｐＨ７．５的１０倍ＴＥ缓冲液，摇动混匀，加入２ｍＬ　　１ｍｏｌ.Ｌ↑［－１］醋酸锂和０．５ｍＬ　　１ｍｏｌ.Ｌ↑［－１］二硫代苏糖醇，旋转混匀，３０℃，５０ｒｐｍ，摇４５ｍｉｎ；　　　　ｅ）菌悬液稀释至５０ｍＬ水中，５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ沉淀细胞，去上清，重复一次；　　　　ｆ）用适量预冷的１ｍｏｌ.Ｌ↑［－１］山梨醇重悬，使最终菌悬液ＯＤ＝２００；按每份８０μＬ分装于１．５ｍＬ离心管中，直接转化或保存于－８０℃；　　　　ｇ）将２０μＬ的ＰＣＲ片段／质粒，与８０μＬ的上述步骤ｆ）所得的菌体混匀，转至０．２ｃｍ冰预冷的电转化杯中，冰浴５ｍｉｎ；　　　　ｈ）采用电穿孔仪进行电转化：电压１．５ｋＶ；电容２５μＦ；电阻２００Ω；电击时间为５ｍｓ；　　　　ｉ）电击完毕后，加入１ｍＬ冰预冷的１ｍｏｌ.Ｌ↑［－１］山梨醇溶液将菌体混匀，转移至１．５ｍＬ的离心管中；　　　　（３）制霉菌素富集技术及限制性培养基筛选技术：　　　　ｊ）将步骤ｉ）所得菌悬液转入ＹＰＤ液体培养基中２４ｈ后，离心；　　　　ｋ）所得菌体用ＮＦＭＭ洗涤后继续在ＮＦＭＭ中培养６ｈ，用ＮＦＭＭ离心洗涤后，再加入ＭＭ培养２ｈ；　　　　ｌ）ＭＭ离心洗涤后，分别加入制霉菌素和蔗糖至终浓度１０μｇ.Ｌ↑［－１］和１７０ｇ.Ｌ↑［－１］，培养３０－１２０ｍｉｎ；　　　　ｍ）将菌体悬液稀释１０，１００，１０００倍分别涂布于ＬＭ平板上；　　　　ｎ）将平板置于３０℃培养，直至单个菌落出现；　　　　ｏ）小菌落为可能的营养缺陷型菌株；　　　　ｐ）挑取平板上的小菌落进一步在ＭＭ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，周景文，陈坚，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]