干巴菌胞外多糖及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及干巴菌多糖技术领域，特别涉及一种干巴菌胞外多糖，制备方法：保藏编号为CGMCC No.12977的干巴菌菌株TG‑1发酵，从发酵液中提取干巴菌胞外多糖，阴离子交换柱层析分离，用去离子水和0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液洗脱，分别得到干巴菌胞外多糖组分EPS‑1，EPS‑2，EPS‑3。干巴菌胞外多糖EPS具有优良的保湿性和抗氧化活性。EPS的三个组分中EPS‑2的抗氧化能力最强，EPS的保湿能力强。干巴菌胞外多糖可广泛应用于抗衰老保健品和化妆品中。

Dry fungus extracellular polysaccharide and preparation method and application thereof

The present invention relates to dry fungus polysaccharide technical field, in particular relates to a dry fungus extracellular polysaccharide, preparation method: the preservation number is CGMCC No.12977 ganba bacteria strain TG 1 ganba bacteria fermentation, extraction of extracellular polysaccharide from fermentation liquid separation, anion exchange chromatography, using deionized water and NaCl solution 0.1, 0.3 mol/L elution, respectively ganba bacteria exopolysaccharide fractions EPS 1, EPS 2 EPS 3. Ganba bacteria extracellular polysaccharide EPS has excellent moisturizing and antioxidant activity. The antioxidant capacity of the EPS in the three groups in EPS 2 strongest, EPS moisturizing ability. Widely used in anti-aging health care products and cosmetics in the dry fungus extracellular polysaccharide.

【技术实现步骤摘要】
干巴菌胞外多糖及其制备方法和应用
本专利技术涉及干巴菌多糖
，特别涉及一种干巴菌胞外多糖，还涉及所述干巴菌胞外多糖的制备方法及其应用。
技术介绍
干巴菌（ThelephoraganbajunZang）是我国特有的革菌属（Thelephora）珍稀野生食用菌，口感好营养价值高，仅仅分布在我国滇中800～2300m高海拔地区的弱酸性红壤地面上。干巴菌与松树有外生菌根关系，人工栽培难以成功，因此导致干巴菌无序乱采现象严重，产量逐年下降，每年干巴菌上市時总是供不应求，价格逐年升高。由于其分布的局限性，国内外对干巴菌的研究极为有限，主要集中在干巴菌的分类、菌种分离、菌种鉴定和生态环境等方面。因此，干巴菌是一种具有极高经济价值及营养价值的亟待研究开发的菌种资源。目前应用于化妆品的多糖类保湿剂主要有透明质酸、甲壳素及其衍生物、植物多糖提取物、肝素等。近年来将具有生物活性的食用真菌多糖作为保湿剂应用于化妆品，满足了人们对高品质化妆品的需求，成为保湿化妆品的发展趋势。干巴菌胞外多糖（Exopolysaccharide,EPS）良好的保湿和抗氧化特性是化妆品市场最重要的功能性诉求。自由基是机体细胞代谢过程中产生的活性物质，如果自由基在体内过多积累就会引起生物膜的不饱和脂类发生氧化反应，形成脂质过氧化物，从而引起细胞结构和功能的改变，造成对机体的损害，引起各种疾病，这就是引起机体衰老的主要原因。干巴菌胞外多糖可以清除体内的自由基，进而起到保护生物膜和延缓衰老的作用。因此，干巴菌胞外多糖可以作为天然、营养、安全的化妆品保湿剂和抗衰老功能食品，从而为干巴菌资源开发提供有效的途径。陆文娟等在《响应面法优化提取干巴菌多糖的工艺研究》《南京师范大学学报(工程技术版)》，2015，15（3）：84-92，以干巴菌子实体为原料，采用超声细胞破碎法提取其多糖，在单因素实验的基础上，采用响应面法对提取工艺进行优化，通过Box-Behnken设计，建立并分析了各因素与多糖得率关系的数学模型，结果显示，最佳工艺条件为：液料比为38:1，提取时间为3h，提取温度为88℃，超声功率为603W，重复2次，测定干巴菌多糖的得率为5.96%。但该项目并没有涉及干巴菌的液体发酵培养、干巴菌多糖的分离纯化以及具有清除自由基、抗氧化功效的多糖组分等研究内容。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中干巴菌胞外多糖EPS在提取和应用中存在的利用不充分的问题，本申请提供了由干巴菌菌株（ThelephoraganbajunZang）TG-1发酵得到的菌丝体胞外多糖EPS。本课题组从云南地区分离纯化得到了一株干巴菌菌株（TG-1），并且研究发现干巴菌在液体发酵培养时菌丝体生长旺盛，胞外多糖产量高，并且通过抗氧化实验和保湿实验证明干巴菌胞外多糖EPS具有良好的保湿和抗氧化特性。本申请还提供了所述干巴菌胞外多糖EPS的制备方法。本申请还提供了所述干巴菌胞外多糖EPS的应用。本专利技术是通过以下步骤得到的：一种干巴菌胞外多糖，其特征在于是通过以下步骤得到的：保藏编号为CGMCCNo.12977的干巴菌菌株TG-1在液体培养基中发酵，从菌丝体分离后得到的发酵液中，提取干巴菌胞外多糖，然后经过阴离子交换柱层析分离，依次用去离子水和0.1、0.3mol/L的NaCl溶液进行洗脱，分别得到干巴菌胞外多糖组分EPS-1，EPS-2，EPS-3。所述的干巴菌胞外多糖EPS，其特征在于EPS、EPS-1、EPS-2、EPS-3中硫酸基的含量分别为15～21%，0.5～2%，25～40%，9～16%；糖醛酸的含量分别为5～10%，2～7%，30～50%，30～50%。所述的干巴菌胞外多糖，液体培养基中含有马铃薯150～250g/L，葡萄糖15～25g/L，硫酸镁0.5～2.5g/L，磷酸二氢钾0.5～2.5g/L，蛋白胨1～3g/L，pH为4.5～7，于15～30℃发酵培养。所述的干巴菌胞外多糖，菌丝体分离，提取干巴菌胞外多糖操作如下：洗涤菌丝体1～4次，至洗涤液澄清，将收集到的上清液或滤液合并，并浓缩至原体积3/4～1/2，加入1～4倍体积乙醇，静置1～24h至胞外多糖完全析出，过滤分离胞外多糖，40～60℃条件下烘干，溶于去离子水中，除蛋白至少2～3次，冻干后得到干巴菌胞外多糖。所述的干巴菌胞外多糖，干巴菌胞外多糖经过阴离子交换柱层析分离操作如下：将干巴菌胞外多糖溶于去离子水中，用0.45μm的微孔滤膜过滤，得到上样溶液，将上样溶液用规格为1.6×30cm的DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行层析分离，依次用去离子水和0.1、0.3mol/L的NaCl溶液进行洗脱，洗脱液的流速为1mL/min，洗脱组分冻干后即为干巴菌胞外多糖组分EPS-1，EPS-2和EPS-3。所述的干巴菌胞外多糖在制备抗衰老保健品和化妆品中的应用。干巴菌胞外多糖为干巴菌胞外多糖EPS及其组分EPS-1，EPS-2和EPS-3。所述的保健品是具有清除自由基、抗氧化作用的保健品。所述的化妆品是具有清除自由基、抗氧化和保湿作用的化妆品。有益效果：1）利用液体发酵途径，制备干巴菌胞外多糖，为干巴菌的资源化利用提供了一条有效途径。2）干巴菌菌株TG-1在液体发酵培养时具有旺盛的胞外多糖分泌能力，因此，干巴菌菌株TG-1对干巴菌的开发利用及干巴菌胞外多糖的规模化生产具有非常重要的意义。3）抗氧化实验表明，干巴菌胞外多糖EPS及其组分具有优良的抗氧化活性，EPS及3个组分抗氧化能力有差异，还原力的强弱顺序为EPS-2>EPS-1>EPS>EPS-3，清除羟基自由基能力的强弱顺序为EPS>EPS-2>EPS-1>EPS-3，清除超氧阴离子自由基能力的强弱顺序为EPS-2>EPS>EPS-1>EPS-3，清除DPPH自由基能力的强弱顺序为EPS-2>EPS>EPS-1>EPS-3，因此，EPS的三个组分中EPS-2的抗氧化能力最强，其次为EPS-1和EPS-3，为干巴菌胞外多糖构效关系的研究、多糖的改造、多糖的活性分析以及多糖抗衰老功能食品的开发奠定了理论基础。4）干巴菌胞外多糖具有优良的保湿能力。在120h时，在相对湿度60%的条件下，EPS的保湿率为55～65%；在相对湿度43%的条件下，EPS的保湿率为85～92%；在相对湿度0%的条件下，EPS的保湿率为25～35%。并且在某些条件下，MPS的保湿能力要强于透明质酸（HA）和甘油（Gl），可以用于护肤保健。菌种保藏信息保藏时间：2016年9月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.12977，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101分类命名：干巴菌Thelephoraganbajun。附图说明图1干巴菌EPS的洗脱曲线，图2干巴菌EPS、EPS-1、EPS-2、EPS-3的体外抗氧化能力(A：还原力；B：羟基自由基清除能力；C：超氧阴离子自由基清除能力；D：DPPH自由基清除能力)，图3保湿率随时间的变化曲线（RH60%），图4保湿率随时间的变化曲线（RH43%），图5保湿率随时间的变化曲线（RH0%）本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干巴菌胞外多糖，其特征在于是通过以下步骤得到的：保藏编号为CGMCC No.12977的干巴菌菌株TG‑1在液体培养基中发酵，从菌丝体分离后得到的滤液中，提取干巴菌胞外多糖EPS，然后经过阴离子交换柱层析分离，依次用去离子水和0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液进行洗脱，分别得到干巴菌胞外多糖组分EPS‑1，EPS‑2，EPS‑3。

【技术特征摘要】
1.一种干巴菌胞外多糖，其特征在于是通过以下步骤得到的：保藏编号为CGMCCNo.12977的干巴菌菌株TG-1在液体培养基中发酵，从菌丝体分离后得到的滤液中，提取干巴菌胞外多糖EPS，然后经过阴离子交换柱层析分离，依次用去离子水和0.1、0.3mol/L的NaCl溶液进行洗脱，分别得到干巴菌胞外多糖组分EPS-1，EPS-2，EPS-3。2.根据权利要求1所述的干巴菌胞外多糖，其特征在于液体培养基中含有马铃薯150～250g/L，葡萄糖15～25g/L，硫酸镁0.5～2.5g/L，磷酸二氢钾0.5～2.5g/L，蛋白胨1～3g/L，pH为4.5～7，发酵培养温度15～30℃。3.根据权利要求1所述的干巴菌胞外多糖，其特征在于菌丝体分离，提取干巴菌胞外多糖操作如下：洗涤菌丝体1～4次，至洗涤液澄清，将收集到的上清液或滤液合并，并浓缩至原体积3/4～1/2，加入1～4倍体积乙醇，静置1～24h至胞外多糖完全析出，过滤分离胞外多糖，40～60℃条件下烘干，溶于去离子...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟庆军，郑岚，杨艳，蔡雷，马耀宏，刘庆艾，
申请(专利权)人：山东省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37