一株海洋细菌及其产生的胞外多糖，涉及一株海洋细菌。所述一株海洋细菌Alteromonase marina P2-B12，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.11180。一株海洋细菌Alteromonase marina P2-B12制备胞外多糖的方法：1)菌株培养；2)多糖的提取及脱盐；3)分离纯化。制备所得的海洋细菌胞外多糖的分子量大于167kDa，海洋细菌胞外多糖由鼠李糖、甘露糖和半乳糖醛酸以α-1，3和α-1，4键结合构成结构单元([-3]-α-Rhap-(1→3)-α-Manp-(1→4)-α-GalAp-(1→))。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株海洋细菌，尤其是涉及一株海洋细菌及其产生的胞外多糖。
技术介绍
细菌普遍合成分泌胞外多糖。胞外多糖是细菌的次级代谢产物，是细菌生长过 程中分泌到细胞壁外形成与菌体分离的可溶性多糖复合物。海洋细菌因其独特的生活 环境，分泌的胞外多糖常常具有特殊结构，因此，海洋细菌生产的胞外多糖在生物技术 领域中具有极大的潜在应用价值。已有一些胞外多糖生产菌从不同的海洋环境中被分 离，例如从深海热液泉口，海洋火山和热液区，以及浅海海底温泉发现了丰富的胞外多糖 生产菌（P〇li，2010)。从浅海热泉分离出的Bacillus属的菌株产生的多糖可以抗病毒 (Gugliandolo,2014)。从北极海冰中分离的Pseudoalteromonas细菌合成的多糖具有抗 冻特性（GugliandoloC,SpanoA,LentiniV,ArenaA,MaugeriTL. 2014,Antiviraland immunomodulatoryeffectsofanovelbacterialexopolysaccharideofshallow marineventorigin.JApplMicrobiol. 116(4):1028-34)〇 近几年，随着对微生物多糖研究的深入，世界上微生物多糖产量的年增长量在 10%以上，而一些新型多糖年增长量在30%以上，现在世界上每年多糖总需求量在100万 吨以上，总价值50~100亿美元。因此，多糖的生产具有巨大的市场价值。然而，当前被 应用于实际生产中的细菌多糖非常有限。因此，有必要筛选、分离新的多糖产生菌，并对 它们所产多糖的结构、物理化学特性进行深入探究，以进一步拓展它们的应用领域。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株海洋细菌AlteromonasemarinaP2-B12。 本专利技术的另一目的在于提供一株海洋细菌AlteromonasemarinaP2-B12制备具 有新颖结构并安全无毒的胞外多糖的方法。 所述一株海洋细菌AlteromonasemarinaP2-B12,已于2015年08月07日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所，邮编：1〇〇1〇1，保藏中心登记入册编号：CGMCCNo. 11180。 本专利技术的海洋细菌AlteromonasemarinaP2-B12是从海水样品中分离得到的，海 水采集于2012年8月，经度115°E，炜度18°N，水深75m;将采集的海水IOOyL吸取涂 布于平板，放置室温培养。待培养3天后，随机从平板上挑取形态大小不同的菌落进行纯化 培养。纯化时用接种环挑取菌落，在平板表面进行划线，观察平板上菌株的颜色、大小、形 态是否相同.挑取不同的菌落划线分离，直到分离出单一形态的菌落为止。通过苯酚-硫 酸法对所得菌株培养上清液是否产多糖进行检测，初筛多糖产量超过l〇〇mg/L，得到该产 多糖菌株。该菌株的特征为：AlteromonasemarinaP2-B12为革兰氏阴性菌，长杆状，在 2216E固体培养基菌落较大（直径2_)，乳白色，圆形，隆起，边缘较圆整，不透明，无迀移 性。 本专利技术通过DNA序列分析确定了其种属关系，属于交替单胞菌属Alteromonase。 该菌株16SrRNA序列见说明书最后部分。 所述一株海洋细菌Alteromonase marina P2-B12制备胞外多糖的方法，具体步骤 如下： 1)菌株培养 以工业葡萄糖为单一碳源添加到人工海水里进行培养，培养基的具体配方为 (IL):葡萄糖10. 〇g/L、氯化钠19.Og/L、氯化氨0. 3g/L、磷酸氢二钾0. 4g/L、氯化钾0. 3g/ L、七水合硫酸镁0. 5g/L、七水合氯化钙0. 03g/L，pH7. 6 ; 将Alteromonase marina P2-B12接种到培养基摇床培养，得种子培养液； 另配制培养基，放入发酵罐中，灭菌，待温度降到25°C，接入种子培养液培养，得 发酵液； 2)多糖的提取及脱盐 将发酵液离心，取上清液，上清液过滤，滤液中加入无水乙醇，静置过夜，然后将 粘稠的菌多糖移入离心管中，加入冰冻无水乙醇浸洗，将沉淀收集，冻干，即得菌多糖的提 取物，再溶解到水中，移入透析袋，将透析袋悬挂到水中，透析过夜，透析过的菌多糖溶液加 入冰冻乙醇再沉淀，冻干，透析除盐后的菌多糖样品即为多糖粗提物； 3)分离纯化 利用离子交换层析对多糖粗提物进行纯化，收集主峰，将收集到的主峰浓缩脱盐、 冷冻干燥，即得海洋细菌胞外多糖。 在步骤1)中，所述摇床培养的条件可为25°C，180rpm，摇床培养过夜；所述灭菌的 条件可为120°C灭菌30min;所述种子培养液的接种量按体积百分数可为1%;所述接入种 子培养液培养可为25 °C，500rpm/min培养94h。 在步骤2)中，所述离心的条件可在8000rpm离心20min;所述过滤可采用0. 45ym 滤膜（MilliporeHAWP04700)过滤；所述滤液中加入无水乙醇可加入按体积比3倍滤液的 无水乙醇；所述静置过夜的温度可为4°C;所述将粘稠的菌多糖移入离心管可采用玻璃棒缠 取粘稠的菌多糖移入50mL离心管中；所述浸洗可加入质量百分浓度为75%的冰冻无水乙 醇浸洗3次；所述透析袋可采用直径16mm，截留分子量3500道尔顿的透析袋；所述加入冰 冻乙醇再沉淀可加入按体积比3倍菌多糖溶液体积的冰冻乙醇再沉淀。 在步骤3)中，所述离子交换层析的条件可为：层析柱规格为I. 6cmX30cm，凝胶类 型为DEAE-Sepharose Fast Flow，用0~2MNaCl进行梯度洗脱，流速为lmL/min。 本专利技术制备所得的海洋细菌胞外多糖的分子量大于167kDa，海洋细菌胞外多糖由 鼠李糖（Rha)、甘露糖（Man)和半乳糖醛酸（GalA)以a-1，3和a-1，4键结合构成结构单 元（-a-Rhap-Q- 3)-a-Manp-(1 - 4)-a-GalAp-Q-))。该海洋细菌胞外多糖的 糖基组成和糖苷键连接方式与其它已报道的多糖都不相同，是一种新颖的胞外多糖。【附图说明】 图1为AlteromonasemarinaP2-B12透射电镜图。在图1中，a的标尺为200nm， b的标尺为0. 2ym。 图2为基于16SrRNA的P2-B12进化树分析。 图3为梯度洗脱收集得到的主峰示意图。 图4为洗脱得到的洗脱峰示意图。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。 实施例1菌株的获得 本专利技术的菌株是通过以下方法筛选得到的：海水采集于2012年8月，经度 115°E，炜度18°N，水深75m。将采集的海水100^吸取涂布于2216￡平板。2216已培 养基：蛋白胨5.Og,酵母膏I.Og,磷酸铁0.Olg,琼脂20.Og,人工海水10当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株海洋细菌Alteromonase marina P2‑B12，已于2015年08月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.11180。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张子莲，焦念志，蔡阮鸿，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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