一种类芽孢杆菌的胞外多糖、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种类芽孢杆菌的胞外多糖、制备方法及其应用。所述的胞外多糖的结构式如式(1)所示，其中，n＝15～30。所述的胞外多糖的平均分子量分布为2500～5000Da，聚合度为15～30，单糖组分为果糖。所述的胞外多糖的单糖组分单一，可以由保藏号为CGMCC NO.8333的类芽孢杆菌BD3526发酵后获得。所述的制备方法中的发酵操作简单易行。本发明专利技术还公开了所述的胞外多糖的提纯方法以及所述的胞外多糖体在外促进婴儿双歧杆菌增殖、体外调节成人肠道菌群的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种类芽孢杆菌的胞外多糖、制备方法及其应用
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种类芽孢杆菌的胞外多糖、制备方法及其应用。
技术介绍
某些微生物(如乳酸菌、类芽孢杆菌、根瘤菌等)在生长代谢过程中，会分泌一类糖类化合物到细胞壁外。其中，依附于微生物细胞壁外的多糖被称为荚膜多糖，以渗透于生长环境中形式存在的为粘液多糖。微生物胞外多糖(简称EPS)不但可以拥有特殊的风味，还具有一定的降血脂、免疫调节、抗肿瘤等功能，因此可以作为食品添加剂。而且，随着食品安全问题越来越受到消费者的重视，如何获得来源明确、产量稳定、功能多样的新型食品添加剂(如增稠剂、乳化剂、稳定剂等)，越来越引起研究者的重视。果聚糖(Levan)，由大量的果糖单元以β(2→6)果糖苷键连接构成聚糖主链并含有少量β(2→1)果糖苷键连接的支链组成。聚合度(简称DP)较低(DP＝2～9)的果聚糖通常称为低聚果糖，聚合度10～30的果聚糖通常称为多聚果糖，聚合度高于40的果聚糖通常称为高聚果糖。部分微生物来源的Levan具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、免疫增强等重要的生物活性，在医药和功能性食品方面具有巨大的应用潜能。目前大量获得Levan有三种方法：化学合成法、微生物发酵液提取和酶法合成。但是，目前化学合成方法合成的Levan仅仅是β-糖苷键连接而成的三糖结构。虽然植物和微生物都能合成Levan，但目前微生物发酵产生的Levan都是高分子量、高聚合度的，通常为2×106～100×106Da(DP远高于40)。而且，目前从微生物发酵液提取Levan产量和蔗糖转化率一般较低，且发酵液中同时存在的其他高聚物和葡萄糖、果糖、低聚果糖等其他产物，因而不利于Levan的规模化纯化。此外，Levan的酶法合成，需要在一定的pH、温度等条件下进行反应，反应条件复杂，难以控制。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服微生物发酵产生的Levan高分子量、高聚合度且发酵产物不利于纯化的缺陷，提供一种类芽孢杆菌的胞外多糖、制备方法及其应用。所述的胞外多糖聚合度适中，单糖成分单一；所述的制备方法简单易行，利于对所述的胞外多糖进行纯化。本专利技术提供一种类芽孢杆菌的胞外多糖，所述胞外多糖的结构式如式(1)所示：其中，n＝15～30。较佳地，所述的胞外多糖的平均分子量分布为2500～5000Da；和/或具有如下的外观：纯白色丝状物或粉末。所述的胞外多糖由本领域常规的产胞外多糖的类芽孢杆菌菌株产生。较佳的，由保藏号为CGMCCNO.8333的类芽孢杆菌(Paenibacillusdamxungensissp.nov.)BD3526产生，以及由以类芽孢杆菌BD3526为出发菌株获得的突变株或衍生物产生。所述的类芽孢杆菌保藏号为CGMCCNO.8333的类芽孢杆菌BD3526已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，并且在中国专利申请CN103740618A中公开，该专利申请的全文为本专利技术所引用。本专利技术提供一种制备所述的类芽孢杆菌的胞外多糖的制备方法，其包括以下的步骤：(1)将类芽孢杆菌CGMCCNO.8333发酵得发酵液；(2)将步骤(1)所得的发酵液在95～100℃加热10～30分钟，冷却至15～25℃后，调节pH至4.4～4.8，静置3～5小时，离心取上清液，加入所述上清液体积2～4倍的80～100％乙醇溶液，静置过夜，离心收集沉淀物，所述的百分比为占乙醇溶液的质量百分比；(3)用50～80℃蒸馏水将步骤(2)所得的沉淀物溶解，获得浓度为0.5～1.0％的沉淀物溶液，所述百分比为占所述沉淀物溶液的质量体积百分比，待所述溶液冷却至20～25℃时加入三氯乙酸，使三氯乙酸最终为4％～10％，所述百分比为占所述溶液的质量体积百分比，再静置离心获得上清液，将所述上清液经过截留分子量为1000Da的膜透析后得到含胞外多糖的水溶液；(4)将步骤(3)所得的含胞外多糖的水溶液干燥后即得胞外多糖粗品。步骤(1)为：将类芽孢杆菌CGMCCNO.8333发酵得发酵液。步骤(1)所述的发酵为本领域常规的发酵；较佳地，所述的发酵为30℃发酵72小时。较佳地，所述的发酵在液体产糖培养基中进行，所述的液体产糖培养基由10％蔗糖、1％胰酪蛋白胨、0.5％酵母膏、0.5％K2HPO4、0.034％CaCl2与蒸馏水组成，所述的百分比为占所述液体产糖培养基的质量百分比。所述的发酵的接种量为本领域常规的接种量；较佳地为1％，所述的百分比为占所述液体产糖培养基的质量百分比。步骤(2)为：将步骤(1)所得的发酵液在95～100℃加热10～30分钟，冷却至15～25℃后，调节pH至4.4～4.8，静置3～5小时，离心取上清液，加入所述上清液体积2～4倍的80～100％乙醇溶液，静置过夜，离心收集沉淀物，所述的百分比为占乙醇溶液的质量百分比。步骤(2)所述的离心的条件为本领域常规；较佳地为14000g离心10分钟。较佳地，所述的调节pH值为调节至4.6。较佳地，步骤(2)所述的乙醇溶液为95％乙醇溶液，所述的百分比为乙醇占乙醇溶液的质量百分比。较佳地，所述乙醇溶液的加入量为所述上清液体积的3倍。步骤(3)为：用50～80℃蒸馏水将步骤(2)所得的沉淀物溶解，获得浓度为0.5～1.0％的沉淀物溶液，所述百分比为占所述沉淀物溶液的质量体积百分比，待所述溶液冷却至20～25℃时加入三氯乙酸，使三氯乙酸最终为4％～10％，所述百分比为占所述溶液的质量体积百分比，再静置离心获得上清液，将所述上清液经过截留分子量为1000Da的膜透析后得到含胞外多糖的水溶液。步骤(3)所述的溶解，较佳地为用60℃蒸馏水将步骤(2)所得的沉淀物溶解，获得浓度为0.8％的沉淀物溶液，所述百分比为占所述沉淀物溶液的质量体积百分比，待所述溶液冷却至25℃时加入三氯乙酸，使三氯乙酸最终为4％，所述百分比为占所述溶液的质量体积百分比。步骤(4)为：将步骤(3)所得的含胞外多糖的水溶液干燥后即得胞外多糖粗品。步骤(4)所述的干燥为本领域常规的干燥；较佳地为真空冷冻干燥；更佳地，为0.160mBar，-30℃条件下真空冷冻干燥72小时。较佳地，所述的类芽孢杆菌的胞外多糖的制备方法，还包括以下的步骤：(5)将步骤(4)制得的胞外多糖粗品溶于0.05mol/L，pH7.60的Tris-HCl缓冲液中，配成溶液，经DEAE-SepharoseFF柱子层析；依次用所述Tris-HCl缓冲液和含0.2～1.2mol/LNaCl的所述Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱，流速为2～6mL/min，于490nm波长处测吸光度，以吸光度对应的管号作图，得洗脱曲线A；(6)将步骤(5)得到的洗脱曲线A中单峰所对应的透析过的水溶液收集，去离子水透析，真空冷冻干燥，得到胞外多糖组份B；(7)将步骤(6)得到的胞外多糖组份B，溶于所述的Tris-HCl缓冲液中，配成溶液，上DEAE-SepharoseCL-4B离子交换柱进行层析；用含0.2～1.2mol/LNaCl的所述Tris-HCl缓冲液洗脱，流速为2～6mL/min，于490nm波长处测吸光度，以吸光度对应的管号作图，得洗脱曲线B；(8)将步骤(7)获得的洗脱曲线B中单峰所对应的透析过的水溶液收集，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种类芽孢杆菌的胞外多糖，其特征在于，所述胞外多糖的结构式如式(1)所示，其中，n＝15～30。

【技术特征摘要】
1.一种制备类芽孢杆菌的胞外多糖的制备方法，所述胞外多糖的结构式如式(1)所示，其中，n＝15～30；所述的胞外多糖的平均分子量为2500～5000Da；其特征在于，其包括以下的步骤：(1)将保藏号为CGMCCNO.8333的类芽孢杆菌(Paenibacillusdamxungensissp.nov.)BD3526发酵得发酵液；(2)将步骤(1)所得的发酵液在95～100℃加热10～30分钟，冷却至15～25℃后，调节pH值至4.4～4.8，静置3～5小时，离心取上清液，加入所述上清液体积2～4倍的80～100％乙醇溶液，静置过夜，离心收集沉淀物，所述的百分比为乙醇占乙醇溶液的质量百分比；(3)用50～80℃蒸馏水将步骤(2)所得的沉淀物溶解，获得浓度为0.5～1.0％的沉淀物溶液，所述百分比为占所述沉淀物溶液的质量体积百分比，待所述溶液冷却至20～25℃时加入三氯乙酸，使三氯乙酸最终为4％～10％，所述百分比为占所述溶液的质量体积百分比，再静置离心获得上清液，将所述上清液经过截留分子量为1000Da的膜透析后得到含胞外多糖的水溶液；(4)将步骤(3)所得的含胞外多糖的水溶液干燥后即得胞外多糖粗品。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的发酵为30℃发酵72小时；所述的发酵在液体产糖培养基中进行，所述的液体产糖培养基由10％蔗糖、1％胰酪蛋白胨、0.5％酵母膏、0.5％K2HPO4、0.034％CaCl2与蒸馏水组成，所述的百分比为占所述液体产糖培养基的质量百分比；步骤(2)所述的离心为14000g离心10分钟；所述的调节pH值为调节至4.6；所述的乙醇溶液为95％乙醇溶液，所述的百分比为占乙醇溶液的质量百分比；所述乙醇溶液的加入量为所述上清液体积的3倍；步骤(3)所述溶解为用60℃蒸馏水将步骤(2)所得的沉淀物溶解，获得浓度为0.8％的沉淀物溶液，所述百分比为占所述沉淀物溶液的质量体积百分比，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴正钧，郭本恒，高彩霞，刘振民，徐晓芬，韩瑨，
申请(专利权)人：光明乳业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31